Burden of Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii Infection in Hospitalized Patients in a Tertiary Care Hospital of Nepal

Introduktion

Acinetobacter baumannii är en aerob bakterie, ickefermentativ, gramnegativ, icke rörlig, cocco-baciller som har ett antal effektiva virulensfaktorer.1 Organismen kan överleva under ett brett spektrum av miljöförhållanden och kvarstår under längre tid på ytor, vilket gör dem till en frekvent orsak till infektionsutbrott och vårdrelaterade infektioner.2 Det största problemet som orsakas av A. baumannii i sjukhusmiljö gäller oftast kritiskt sjuka patienter på intensivvårdsavdelningar (ICU), särskilt de som kräver mekanisk ventilation, och patienter med sår- eller brännskador. Infektioner som förknippas med A. baumannii är bland annat respiratorassocierad pneumoni, hud- och mjukdelsinfektioner, sårinfektioner, urinvägsinfektioner, sekundär meningit och blodströmsinfektioner.3

Acinetobacter baumannii har framträtt som en viktig MDR nosokomial patogen i hela världen och har rapporterats i allt större utsträckning under det senaste decenniet, vilket troligen beror på den ökande användningen av bredspektrumantibiotika hos sjukhusvårdade patienter.4 Infectious Diseases Society of America (ISDA) har angett A. baumannii som en av de ”red alert”-patogener som i hög grad hotar användbarheten av vårt nuvarande antibakteriella arsenal.5 Ett flertal studier har visat på en uppåtgående trend i prevalensen av MDR A. baumannii, men resistenshastigheterna kan variera kraftigt beroende på vilket sjukhus, vilken stad eller vilket land det gäller. Eftersom MDR Acinetobacter-infektioner vanligtvis inträffar hos svårt sjuka patienter är den associerade råmortaliteten hög och varierar mellan 26 % och 68 %.6

Multraresistenta A. baumannii har utvecklat resistens mot de flesta tillgängliga antibiotika, inklusive karbapenemer, som är de bästa läkemedlen vid behandling av svåra infektioner.7 Den huvudsakliga mekanismen för β-laktamresistens hos A. baumannii motsvarar effluxpumpar, porinmutationer och produktion av förvärvade β-laktamhydrolyserande enzymer, dvs. klass A (extended-spectrum β-laktamas, ESBL), klass B (metallo-β-laktamas, MBL), klass C ampicillinas (AmpC) samt klass D β-laktamas. Karbapenemresistens på grund av produktion av MBL och andra karbapenemaser har en potential för snabb spridning i sjukhusmiljöer, eftersom den ofta är plasmidmedierad och tidig upptäckt av läkemedelsresistens är nödvändig för att man ska kunna göra ett korrekt val av antibiotika för att behandla A. baumannii-infektioner hos sjukhuspatienter och för att kunna inleda effektiva infektionsbekämpningsåtgärder för att förhindra att de sprids i sjukhusmiljöer8,9 .

Med ovanstående synpunkter i åtanke utfördes studien på A. baumannii som isolerats från sjukhuspatienter för att bestämma deras antibiotikakänslighetsmönster, för att identifiera MDR-stammar och för att upptäcka olika β-laktamaser bland MDR-isolat.

Material och metoder

Den laboratoriebaserade studien genomfördes vid avdelningen för klinisk mikrobiologi, Tribhuvan University Teaching Hospital (TUTH), ett tertiärvårdscentrum i Nepal, från januari 2017 till december 2017 (under en period på 12 månader). Alla kliniska prover som samlades in från de sjukhusvårdade patienter som misstänktes för infektioner och som representerade olika kroppsställen (sputum, bronkoalveolärt lavage, endotrakealt aspirat, pus och svabbprover, olika kroppsvätskor, urin, blod, kateterspetsar etc.) behandlades enligt mikrobiologiska standardmetoder som rekommenderas av American Society for Microbiology (ASM) för isolering och identifiering av A. baumannii10 .

Testning av antibiotikakänslighet (AST)

A. baumannii isolats känslighet för olika antibiotika bestämdes med den modifierade Kirby-Bauer-diskdiffusionsmetoden på Mueller-Hinton-agar och tolkades enligt de standardförfaranden som rekommenderas av Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), Wayne, USA.11 Antibiotikakänslighetsprofilen för alla isolat av A. baumannii bestämdes genom tester mot ampicillin-sulbactam (10/10 μg), ceftazidim (30 μg), gentamicin (10 μg), ciprofloxacin (5 μg), levofloxacin (5 μg), meropenem (10 μg) och imipenem (10 μg). De isolat som var resistenta mot minst ett antimikrobiellt medel från tre olika grupper av ovan nämnda antibiotika (dvs. MDR-isolat) testades också mot piperacillin (100 μg), piperacillin-tazobactam (100/10 μg), cefotaxim (30 μg), cefepim (30 μg), kotrimoxazol (25 μg), amikacin (30 μg), doxycyklin (30 μg), polymyxin B (300 enheter) och colistinsulfat (10 μg) från HiMedia Laboratories, Indien.

Identifiering av MDR-isolat

Multidrug-resistenta A. baumannii isolat identifierades enligt de riktlinjer som rekommenderas av Europeiska centrumet för förebyggande och kontroll av sjukdomar (ECDC). De isolat som inte var mottagliga för minst ett antimikrobiellt medel i tre eller fler antimikrobiella klasser identifierades som MDR.12

Detektering av producenter av extended-spektrum-β-laktamas (ESBL)

Det initiala screeningtestet för produktion av ESBL utfördes genom testning med ceftazidim (CAZ, 30 μg) och cefotaxim (CTX, 30 μg) skivor. Isolaten betraktades som potentiella ESBL-producenter när zonen av hämning (ZOI) var antingen <18 mm för CAZ eller <23 mm för CTX. Isolat som misstänktes vara ESBL-producenter genom screen-test testades ytterligare med kombinationsdiskmetoden (CD) för bekräftelse av ESBL-produktion, där CAZ och CTX användes ensamma och i kombination med clavulansyra. Efter inkubation i 16-18 timmar vid 35±2 °C bekräftades en ökning av ZOI på ≥5 mm för något av de antimikrobiella medlen i kombination med clavulansyra jämfört med dess inhiberingszon när de testades ensamma som positiva ESBL-producenter.11

Detektion av AmpC β-laktamasproducenter

Acinetobacter baumannii som producerade en inhiberingszon <18 mm för cefoxitin (CX, 30 μg) skiva testades för AmpC β-laktamasproduktion. AmpC β-laktamas påvisades med hjälp av AmpC-skivtestet. I denna metod inokulerades cefoxitinkänslig Escherichia coli-indikatorstam (ATCC 25922) på en standard MHA-platta för att bilda en gräskultur och en cefoxitindisk placerades. En tom skiva med en diameter på 6 mm, fuktad med Tris-EDTA-buffert, inokulerades med några få kolonier av teststammen och placerades bredvid cefoxitinskivan. Plattorna inkuberades vid 37 °C över natten. Efter inkubation över natten betraktades en fördjupning i cefoxitinhämmningszonen intill skivan som innehöll teststammen som positiv för produktion av AmpC β-laktamas.13

Detektion av producenter av metallo β-laktamas (MBL) och Klebsiella pneumoniae karbapenemas (KPC)

Isolaten utsattes för detektion av MBL- och KPC-produktion när de var resistenta mot meropenem (MEM, 10 μg). Kombinationsmetoden med meropenemskivor användes för detektion och differentiering av MBL, KPC eller samproducent av KPC/MBL enligt Tsakris et al14 I detta test användes fyra skivor; (a) MEM = en vanlig MEM-skiva (10 μg), b) MEM+EDTA = MEM-skiva (10 μg) med 292 μg EDTA, c) MEM+fenylboronsyra (PBA) = MEM-skiva (10 μg) som innehåller 400 μg PBA, och d) MEM+EDTA+PBA = MEM-skiva (10 μg) med både 292 μg EDTA och 400 μg PBA. EDTA fungerar som en hämmare av MBL medan PBA är en KPC-hämmare. Testet utfördes genom att en Mueller-Hinton-agar inokulerades med testorganismen i enlighet med standarddiffusionsmetoden och fyra skivor applicerades. Efter inkubation över natten vid 37 °C jämfördes ZOI-diametern runt MEM+EDTA-, MEM+PBA- och MEM+EDTA+PBA-skivorna med diametern runt den vanliga MEM-skivan. Produktion av MBL ansågs ske när ZOI-diametern runt MEM+EDTA- och MEM+EDTA+PBA-skivorna ökade ≥5 mm jämfört med ZOI-diametern runt den enda MEM-skivan. Produktion av KPC ansågs ske när ZOI-diametern runt MEM+PBA- och MEM+EDTA+PBA-skivorna ökade ≥5 mm jämfört med ZOI-diametern runt enbart MEM-skivan. Samproduktion av både KPC- och MBL-enzymer ansågs ske när ZOI-diametern runt MEM+EDTA+PBA-skivorna ökade ≥5 mm jämfört med ZOI-diametern runt MEM-skivan ensam. Det bör noteras att den koncentration av PBA och EDTA som användes i denna studie inte visade någon påvisbar effekt på bakterietillväxten.

Databearbetning och analys

Data om patientdemografi, prover, avdelningar, antibakteriella profiler, resistensbestämningar analyserades med hjälp av SPSS 16.0-versionen och tolkades enligt frekvensfördelning och procentuell andel.

Resultat

Under studieperioden isolerades totalt 177 A. baumannii. Av de totala isolaten av A. baumannii identifierades de flesta (N=161, 91,0 %) som MDR.

Fördelning av MDR Acinetobacter baumannii

Av de 161 MDR-isolaten var majoriteten (47.2 %) isolerades från prover från luftvägarna (dvs. sputum, bronkoalveolärt lavage och luftrörsaspirat) följt av pus och svabbar, kroppsvätskor, urin, blod och minst från kateterspetsar (1,2 %) (tabell 1). Av de totala MDR-isolaten isolerades 58,3 % från manliga och 41,7 % från kvinnliga patienter, med ett förhållande mellan män och kvinnor på 1,4. The highest number of isolates were from male patients with age group ≥65 years (14.9%) and the least number was isolated from a female patient with age group 49–64 years (5.0%) (Table 2). Similarly, the higher number of MDR isolates were isolated from ICU patients (49.6%) followed by surgical wards (19.9%) and medical wards (14.3%), while the lowest number from burn wards (1.9%) (Table 3).

Table 1 Distribution of MDR Acinetobacter baumannii in Various Clinical Specimens

Table 2 Distribution of MDR Acinetobacter baumannii by Gender and Age Group of Patients

Tabell 3 Fördelning på avdelningar av MDR Acinetobacter baumannii

Antibiogram av MDR Acinetobacter baumannii

Antibiotikakänslighetsprofilen visar att de flesta MDR-isolat var resistenta mot majoriteten av de första-linjens antibiotika. Bland dem var alla isolat helt resistenta mot piperacillin och cefotaxim. Likaså var 99,4 % resistenta mot ceftazidim och cefepim, 98,7 % mot cotrimoxazol, 95 % mot piperacillin-tazobaktam och ciprofloxacin, 93,8 % mot gentamicin, 89,4 % resistenta mot ampicillin-sulbactam och meropenem. Endast 11,8 %, 12,4 %, 13,6 % och 37,9 % var känsliga för levofloxacin, imipenem, amikacin respektive doxycyklin. Alla MDR-isolat var helt känsliga för endast sistahandsantibiotika, dvs. polymyxin B och colistinsulfat (figur 1).

Figure 1 Percentage of antimicrobial resistance and sensitivity of MDR A. baumannii (N = 161).

ESBL, AmpC, MBL, and KPC Production in MDR Acinetobacter baumannii

In this study, the rate of β-lactamases production among MDR isolates was significantly high. MBL was the common β-lactamase detected among MDR A. baumannii (67.7%). ESBL was detected in 19.9%, AmpC in 38.5%, and KPC in 9.3% of MDR isolates. The co-production of different types of β-lactamases was also seen among some isolates. ESBL+AmpC co-producers were seen in 6.8%, ESBL+MBL co-producers in 5.0%, AmpC+MBL co-producers in 23.0% and MBL+KPC in 5.6% of MDR isolates (Table 4).

Table 4 β-Lactamases Production Among MDR Acinetobacter baumannii

Discussion

Acinetobacter baumannii är en viktig nosokomial patogen som är förknippad med en stor mängd olika sjukdomar hos sjukhuspatienter, särskilt på intensivvårdsavdelningar, och som innebär en större utmaning för patientens hantering och infektionskontroll. Den globala uppkomsten av MDR-isolat av A. baumannii ger upphov till stor oro.15

I vår studie isolerades MDR A. baumannii ofta från prover från luftvägarna (47,2 %), följt av pus och svabbprover (27,3 %), kroppsvätskor (11,1 %) och andra. En studie utförd av Shrestha et al 201515 från samma sjukhus rapporterade också 49,18 % MDR A. baumannii från prover från luftvägarna och Samawi et al16 från Qatar rapporterade 48,9 % A. baumannii från infektioner i luftvägarna. De demografiska uppgifterna i vår studie visade att det fanns en hög prevalens av infektioner hos manliga patienter med en ålder ≥65 år och att en majoritet av MDR-isolaten kom från intensivvårdspatienter eftersom dessa bakterier har en förkärlek för högre åldersgrupper och svårt sjuka intensivvårdspatienter.

Fördelningen av MDR A. baumannii i vår studie är 91,0 %, vilket är mycket högt. Även i den studie som gjordes av Shrestha et al och Mishra et al var cirka 96 % respektive 95 % av A. baumannii MDR.17,18 Denna höga prevalens av MDR A. baumannii kan bero på den stora chansen till spridning av resistensgenen och deras förmåga att förekomma överallt i sjukhusmiljön. A. baumannii-infektionen med höga MDR-isolat har också larmat oss om att det finns ytterligare behov av omfattande studier och tillämpning av förebyggande åtgärder för att minska ett sådant fruktansvärt hot hos sjukhusvårdade patienter. Multidrug-resistenta A. baumannii isolat visade sig vara signifikant resistenta mot karbapenemer, aminoglykosider och fluorokinolongrupper av antibiotika i den här studien. Nästan alla MDR-isolat var resistenta mot piperacillin och cefalosporiner, 93,8 % resistenta mot gentamycin och 89,4 % mot meropenem, vilket är högre än vad som rapporterades av Mishra et al18 från samma sjukhus (nästan 89 % och 50 % av isolaten var cefalosporin- respektive karbapenemresistenta). En studie utförd av Xia et al i Kina visade på karbapenemresistens hos 85 % av isolaten, vilket nästan liknar denna studie.19 MYSTIC-programmet (Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection) från 2007 visade att 74,1 % av isolaten var mottagliga för meropenem och 78,9 % var mottagliga för imipenem i Europa, vilket kan jämföras med mycket lägre mottaglighet på 51,3 % och 52,0 % i flera asiatiska länder.20,21 Vårt resultat för resistenshastigheten mot amikacin var 86.3 %, vilket är högre än 54 % i den tidigare studien från samma sjukhus.18 Den ökande uppkomsten av starkt aminoglykosidresistenta stammar ger också anledning till stor oro. I den här studien var 95,0 % och 88,2 % av MDR A. baumannii resistenta mot ciprofloxacin respektive levofloxacin. Fluorokinolonresistensen ökar snabbt i kliniska isolat under de senaste åren på grund av deras breda användning i klinisk medicin som antimikrobiella medel med brett spektrum. I vår studie visade polymyxin B och kolistinsulfat utmärkt effekt mot MDR A. baumannii eftersom inget av isolaten visade sig vara resistent mot kolistinsulfat och polymyxin B. Men i studien av Joseph et al22 och Al-Sweih et al23 var 20 % respektive 12 % av Acinetobacter spp. resistenta mot kolistinsulfat. Den aktuella studien har dock visat på en hög antibiotikaresistens mot vanligt förekommande antibiotika och är en nackdel för hälso- och sjukvårdssystemet i länder som Nepal eftersom det i hög grad kan påverka patienthanteringen. Detta kan bero på den intensiva användningen av antimikrobiella medel på sjukhus, den lätta tillgängligheten och den urskillningslösa användningen av dessa läkemedel utanför sjukhusen, och att många antibiotika är tillgängliga över disk för självmedicinering. Utvecklingen av antibiotikaresistens är förknippad med hög morbiditet och mortalitet hos sjukhuspatienter, särskilt på intensivvårdsavdelningar.

Den minskade känsligheten hos A. baumannii för tredje generationens och fjärde generationens cefalosporiner skulle kunna tillskrivas producenter av ESBL eller AmpC-β-laktamas eller några andra relevanta underliggande mekanismer. Denna studie visade att 19,9 % av MDR A. baumannii var ESBL-producenter. En liknande andel ESBL hittades i en tidigare studie av Parajuli et al på intensivvårdspatienter.24 I studien av Mishra et al18 var endast 12,9 % av Acinetobacter spp. ESBL-producenter. I en indisk studie25 var endast 7 % av isolaten av A. baumannii ESBL-producenter, medan en annan studie från Indien8 dokumenterade att 29,9 % av Acinetobacter spp. var ESBL-producenter. Studier har visat att prevalensen av ESBL varierar från land till land och från institution till institution i både nosokomiala isolat och samhällsisolat. Detta kan bero på antibiotikaförskrivningsvanor och förekomsten av patogener som bär på gener för ESBL-produktion. Även om det inte finns några CLSI-riktlinjer för detektion av produktion av AmpC-β-laktamaserna har vi följt AmpC-disk-testet.13 I den aktuella studien hittades prevalensen av AmpC-producerande MDR A. baumannii på 35,6 %. Nästan en liknande prevalens av AmpC-producerande Acinetobacter spp. har rapporterats från samma sjukhus av Parajuli et al.24 I en indisk studie dokumenterades dock en högre frekvens (56 %) av AmpC-producerande A. baumannii.26

Carbapenemresistenta Acinetobacter baumannii (CRAB) ingår i prioritet 1 (dvs. kritisk) i en global prioriteringslista över antibiotikaresistenta bakterier för att vägleda forskning, upptäckt och utveckling av nya läkemedel som Världshälsoorganisationen har utarbetat.27 Även om det finns olika mekanismer för karbapenemresistens är produktionen av enzymet karbapenemas den mest effektiva mekanismen.9 Uppkomsten av MBL hos A. baumannii blir en terapeutisk utmaning eftersom dessa enzymer har hög hydrolytisk aktivitet som leder till nedbrytning av högre generationens cefalosporiner och karbapenemer. Dessutom sprids plasmidmedierade MBL-gener snabbt till andra arter av gramnegativa bakterier.28 Därför är snabb upptäckt av MBL-produktion nödvändig för att ändra terapin och inleda effektiv infektionskontroll för att förhindra att de sprids. I den aktuella studien var metallo β-laktamas (MBL)-producerande isolat vanligare än ESBL- och AmpC-producenter, där 67,7 % av MDR A. baumannii var MBL-producenter. I Nepal har få studier gjorts om prevalensen av MBL, Shrestha et al29 rapporterade 47,2 % och Parajuli et al24 rapporterade 78,8 % MBL-producenter hos Acinetobacter spp. från samma sjukhus. I studien av Dey och Bairy30 rapporterades MBL endast hos 21,7 % av Acinetobacter spp. Att flera MBL-gener förekommer samtidigt i bakterier är en alarmerande situation. Eftersom MBL-gener är förknippade med integroner som kan inbäddas i transposoner, som i sin tur kan placeras på plasmider, vilket resulterar i en mycket rörlig genetisk apparat, är det troligt att dessa gener kommer att spridas ytterligare i olika patogener. I denna studie försökte man också ta reda på de KPC-producerande isolaten, där 9,5 % var MDR A. baumannii och några av dem också samproducerade MBL-enzym. Även om det inte fanns någon enskild artikel om upptäckt av KPC från Nepal, rapporterade Parajuli et al24 nyligen KPC-producerande Acinetobacter-arter från intensivvårdspatienter. De flesta KPC-producerande isolat har rapporterats från USA, Grekland, Kina, Israel och Colombia.31 Bland karbapenemaserna har KPC en hög frekvens och har ofta påträffats i Klebsiella pneumonia.32 Bland de β-laktamasproducerande isolaten var en del av isolaten också samproducenter av olika β-laktamaser, och MDR-isolat som producerade två olika typer av β-laktamaser uppvisade en högresistent profil. Spridningen av karbapenemasproducerande bakterier över hela världen under de senaste åren har betraktats som ett stort hot mot folkhälsan. Efter att de karbapenemresistenta klonerna har dykt upp, kvarstår hoppet om behandling av MDR A. baumannii-infektion genom den sista utvägen av potentiellt giftiga antibiotika som polymyxin B och colistinsulfat.33

Studien visar att infektion med MDR A. baumannii ökar i en alarmerande takt på vårt sjukhus. Det har nu blivit mycket viktigt att kontrollera denna situation innan den tar en dödlig form. Därför är snabb upptäckt av resistensbestämningsfaktorerna nödvändig för att modifiera terapin och inleda effektiv infektionskontroll för att förhindra deras spridning.

Begränsningar

Vi kunde inte utvärdera riskfaktorer och utfall av MDR A. baumannii-infektioner hos sjukhuspatienter på grund av att tillräckliga uppgifter från patienterna inte fanns tillgängliga. Vidare fastställdes inte heller genetisk analys av de resistenta fenotyperna och läkemedelsresistensmekanismerna.

Slutsats

Från denna studie står det klart att infektioner hos hospitaliserade patienter på grund av MDR A. baumannii är vanliga. Frekvensen av MBL-, ESBL- och AmpC-produktion bland MDR-isolat har ökat kraftigt och dessa bakterier kan leda till hög morbiditet och mortalitet eftersom vi har det enda alternativet att behandla dem med potentiellt giftiga antibiotika som colistinsulfat och polymyxin B och detta är det vexerande problemet för sjukhusvårdade patienter. Fastställda rekommendationer som omfattar korrekt upptäckt av läkemedelsresistens hos patogener, antimikrobiella restriktioner för att undvika överdriven användning av bredspektrumantibiotika, förbättrade system för övervakning av resistens och rigorösa åtgärder för infektionskontroll kommer att bidra till att kontrollera denna situation.