Distinct fibroblast subsets regulate lacteal integrity through YAP/TAZ-induced VEGF-C in intestinal villi

Experimental animals

Alla djurvård och experimentella förfaranden följde alla etiska regler för djurforskning och djurförsök och godkändes av institutionens kommitté för djurskydd och djuranvändning (No. KA2016-12) från Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). Pdgfrb-Cre-ERT2 30, Lats1fl/fl/Lats2fl/fl31,32 och Yapfl/fl/Tazfl/fl 38 möss överfördes, etablerades och föddes upp i djuranläggningar som är fria från specifika patogener (SPF) vid KAIST. C57BL/6 J-, R26-tdTomato och Myh11-Cre-ERT2-möss köptes från Jackson Laboratory. Alla möss hölls i C57BL/6-bakgrund och utfodrades med fri tillgång till standardfoder (PMI LabDiet) och vatten. För att inducera Cre-aktivitet hos Cre-ERT2-mössen injicerades 2 mg tamoxifen (Sigma-Aldrich) löst i majsolja (Sigma-Aldrich) intraperitonealt (i.p.) vid angivna tidpunkter för varje försök. Cre-ERT2-negativa men flox/flox-positiva möss bland kullsyskon definierades som kontrollmöss (WT) för varje experiment. Mössen sövdes med i.p. injektion av en kombination av bedövningsmedel (80 mg/kg ketamin och 12 mg/kg xylazin) innan de offrades.

Histologiska analyser

För helmonterad färgning av tunntarmen utfördes transkardiell perfusion med 2 % paraformaldehyd (PFA) efter bedövning. Tunntarmen skördades och skars i längsled för att exponera lumen. Efter flera sköljningar med PBS fästes tarmarna på kiselplattor. Proverna postfixerades sedan vid 4 °C i 4 % PFA i 2 timmar. Proverna tvättades med PBS flera gånger och dehydratiserades därefter med 10 % sackaros i PBS i 2 timmar och med 20 % sackaros, 10 % glycerol i PBS över natten. Öronhud, luftrör och diafragma togs ut utan transkardiell perfusion och fixerades i 4 % PFA i 1 timme vid 4 °C. Proverna tvättades med PBS flera gånger före blockering. Efter blockering med 5 % get- eller åsnerum i 0,5 % Triton-X 100 i PBS (PBST) i 1 timme inkuberades proverna med de angivna primära antikropparna utspädda i blockeringslösningen vid 4 °C över natten. Efter flera tvättar med PBST inkuberades proverna i 2 timmar i rumstemperatur (RT) med de angivna fluorokromkonjugerade sekundära antikropparna utspädda i blockeringsbufferten. Proverna tvättades med PBST och kärnorna färgades med DAPI (Invitrogen). Efter tvätt med PBS monterades proverna med Vecta-shield (Vector Laboratories). Bilder togs med hjälp av Zeiss LSM 800 eller LSM 880 konfokalmikroskop (Carl Zeiss).

Följande primära och sekundära antikroppar användes vid immunfärgningen: anti-LYVE-1 (kaninpolyklonalt, 11-034, Angiobio, 1:400); anti-CD31 (råttmonoklonal, 557355, BD Biosciences, 1:400); anti-CD31 (monoklonal för hamster, MAB1398Z, Merck, 1:400); anti-E-cadherin (polyklonal för get, AF748, R&D, 1:200); anti-Prox1 (polyklonal för get, AF2727, R&D, 1:400); anti-Prox1 (kaninpolyklonalt, 102-PA32AG, ReliaTech, 1:400); anti-VE-cadherin (getpolyklonalt, AF1002, R&D, 1:200); anti-PDGFRβ (råttmonoklonalt, ab91066, Abcam, 1:200); anti-PAI-1 (musmonoklonal, sc-5297, Santa Cruz, 1:100); anti-Serpina3n (getpolyklonalt, AF4709, R&D, 1:200); anti-Fosb (kaninmonoklonal, 2251, Cell Signaling Technology, 1:400); anti-Shisa3 (kaninpolyklonalt, TA320118, Origene, 1:400); anti-P2X1 (kaninpolyklonalt, APR-001, Alomone labs, 1:800); anti-Ackr4 (kaninpolyklonalt, SAB4502137, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-Grem1 (getpolyklonalt, AF956, R&D, 1:200); anti-Sox6 (kaninpolyklonalt, ab30455, Abcam, 1:400); anti-PDGFRα (getpolyklonalt, AF1062, R&D, 1:200); anti-YAP (monoklonal kanin, 14074, Cell signaling, 1:200); anti-TAZ (polyklonalt kanin, HPA007415, Sigma-Aldrich, 1:200); anti-αSMA, Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-konjugerad (monoklonalt musmonoklonalt, F3777, Sigma-Aldrich, 1:1000); anti-VEGFR3 (getpolyklonalt, AF743, R&D, 1:200); anti-VEGFR2 (getpolyklonalt, AF644, R&D, 1:200); anti-PGP9.5 (kanin monoklonal, 13179, Cell signaling, 1:400); anti-F4/80, FITC-konjugerad (råttmonoklonal, 1231007, Biolegend, 1:200); anti-CD3 (hamster monoklonal, 553058, BD Biosciences, 1:1000); anti-Desmin (kaninpolyklonalt, AB907, Millipore, 1:400) och Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647-konjugerade sekundära antikroppar mot kanin, råtta, get och hamster (utspädda i förhållandet 1:1000) köptes från Jackson ImmunoResearch. Alla antikroppar som användes i vår studie var validerade för arten och applikationerna.

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH)

För smFISH av tunntarmen utfördes transkardiell perfusion med 2 % PFA efter anestesi. Proverna postfixerades vid 4 °C i 4 % PFA i 2 timmar. Proverna tvättades med PBS flera gånger, flyttades till 30 % sackaros och inkuberades över natten. Proverna som var inbäddade i OCT sektionerades och vi utförde smFISH enligt tillverkarens protokoll som beskrivs i RNAscope Fluorescent Multiplex Assay-kitet (320850, ACDBio). RNA scope Probe (ACDBio)-Mm-vegfc (492701-C2) användes för smFISH. Följande primära och sekundära antikroppar användes vid immunfärgning med smFISH: anti-PDGFRβ (monoklonal råtta, ab91066, Abcam), anti-Shisa3 (polyklonalt kanin, TA320118, Origene), anti-P2X1 (polyklonalt kanin, APR-001, Alomone labs) och Alexa Fluor 488-, Alexa Fluor 594-, Alexa Fluor 647-konjugerade sekundära antikroppar köptes från Jackson ImmunoResearch. Bilderna togs med hjälp av Zeiss LSM 800 eller LSM 880 konfokalmikroskop (Carl Zeiss).

EdU-inkorporeringsanalys för prolifererande LECs

För att detektera prolifererande LECs i laktat löstes 5 mg 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU, A10044, Invitrogen) upp i 1 ml Milli-Q-vatten som en stamlösning. Därefter injicerades 200 μl av stamlösningen per mus i.p. varannan dag i en vecka före analysen. Tunntarmen isolerades och bearbetades enligt beskrivningen ovan. EdU-inkorporerade celler detekterades med Click-iT EdU Alexa Fluor-488 Assay Kit (Invitrogen) enligt tillverkarens protokoll.

Elektronmikroskopi

För att fånga ultrastrukturella elektronmikroskopiska bilder av lakteal sektionerades tunntarmen efter transkardiell perfusion med 4 % PFA och 0,25 % glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert (pH 7,4). Proverna fixerades sedan över natten i 2,5 % glutaraldehyd, postfixerades med 1 % osmiumtetroxid och dehydratiserades med en serie ökande etanolkoncentrationer följt av inbäddning i harts. 70 nm ultratunna laktatsektioner togs fram med hjälp av en ultramikrotom (UltraCut-UCT, Leica), som sedan samlades på koppargaller. Proverna avbildades med transmissions EM (Tecnai G2 Spirit Twin, FEI) vid 120 kV efter färgning med 2 % uranylacetat och blycitrat.

Intravital avbildning av lipidclearance från lamina propria

Möss bedövades efter att maten avlägsnats i 12 timmar före proceduren. Intravital avbildning utfördes som vi tidigare beskrivit34. Kortfattat löstes BODIPY lipidsonder (0,1 mg/ml, Thermo Fisher) i 2,5 % DMSO-lösning (Sigma-Aldrich). Anti-LYVE-1 (råttmonoklonal, 223322, R&D) konjugerad med Alexa Fluor 647 (Invitrogen) antikropp (0,75 mg/kg) injicerades intravenöst 12 timmar före avbildningen för fluorescerande märkning av mjölkkärl. Därefter externerades den proximala jejunum i en avbildningskammare där temperaturen hölls på 37 °C under avbildningen. Efter en kirurgisk öppning av tarmlumen 1,5 cm längs den antimesenteriska gränsen placerades ett täckglas på det exponerade lumen för att få en bild av villi. Den intravitala avbildningen utfördes under tre sessioner. Först avbildades villien före tillförsel av BODIPY-FA vid 0 min. Därefter tillfördes 30 μl BODIPY-lipidsonder en gång före det andra bildtagningstillfället för att observera den initiala BODIPY-lipidabsorptionen vid 1 minut. Därefter tillfördes BODIPY-lipiderna tre gånger med 2 minuters mellanrum före det tredje bildtagningstillfället vid 26 minuter, och BODIPY-FA-clearingen genom mjölkkärlen analyserades vid 36 minuter och 46 minuter. Ett hemmabyggt konfokalt mikroskop med videofrekvens och laserskanning användes34. Två kontinuerliga lasrar som avger 488 nm (MLD, Coherent) och 640 nm (Cube, Coherent) användes som excitationskällor för fluorescensavbildning. Två bandpassfilter (FF01-525/50 och FF01-685/40, Semrock) användes för detektion av fluorescerande signaler. Axial upplösning under 4 μm förvärvades med 100 μm pinhole och 60x objektiv (LUMFLN, vattenimmersion, NA 1,1, Olympus). Bilder (512 × 512 pixlar) togs med en bildfrekvens på 30 Hz. För att förbättra signal-brusförhållandet i bilderna medelvärdesbildades bruset över 90 bilder efter efterbearbetning av realtidsbilderna (30 bilder/sek.) genom att rörelseartefakter som genereras av peristaltik avlägsnades med ett skräddarsytt MATLAB-program. ImageJ-programvaran (NIH) användes för att mäta den genomsnittliga fluorescerande intensiteten i lamina propria.

Lipidabsorptionstest

Efter att maten avlägsnats i 12 timmar gavs 200 μl olivolja (Sigma-Aldrich) genom oral giva för mätning av plasmatriglycerider och färgning med Oil Red O. Blodprov togs via svansvenen i ett blodprovtagningsrör som innehöll heparin 0, 1, 2, 3 och 4 timmar efter olivoljetillförseln. Triglyceridkoncentrationen i plasma mättes med hjälp av en VetTest Chemistry-analysator (IDEXX Lab). Tunntarmen färgades med oljeröd O 12 timmar efter giva av olivolja enligt tillverkarens protokoll för Oil Red O Staining Kit (MAK194, Sigma-Aldrich). Utfodring med hög fetthalt (HFD) (60 % kcal fett, Research Diets, D12492) inleddes vid 12 veckors ålder och fortsatte i 8 veckor för mätning av plasmatriglycerider och färgning med Oil Red O. Blodprov togs via svansvenen i ett blodprovtagningsrör som innehöll heparin efter 6 timmars fasta. För färgning av leversektioner med oljeröd O färgades levern, som skördades, fixerades i 4 % PFA över natten vid 4 °C, klipptes till 100 μm vibratomsektioner (Leica, VT1200S) och färgades med oljeröd O.

Transduktion av AAV

Indikerade möss fick en enda i.p. dos (1012 viruspartiklar i 150-200 µl) av ett rekombinant AAV som kodar för de ligandbindande domänerna 1-4 av VEGFR3 fusionerade till IgG Fc-domänen (AAV-mVEGFR31-4-Ig), och kontrollmöss fick samma dos AAV som kodar för domänerna 4-7 av VEGFR3, som inte binder VEGF-C eller VEGF-D (AAV-mVEGFR34-7-Ig), fusionerade till IgG Fc-domänen, som tidigare beskrivits37. AAV-mVEGFR31-4-Ig och AAV-mVEGFR34-7-Ig påvisades i serum genom immunoblottinganalys (anti-VEGFR3-antikropp; polyklonal get, AF743, R&D) av 0.5 μl av serumprover som samlades in samma dag som tarmanalysen.

Behandling av antikroppar

För VEGFR2-blockering använde vi en VEGFR2-neutraliserande antikropp (DC101). En hybridomcellinje som producerar DC101 köptes från American Type Culture Collection (ATCC). Hybridomcellerna odlades i serumfritt medium. Rekombinanta proteiner i supernatanten renades genom kolonnkromatografi med Protein A agarosgel (Oncogene). Efter rening kvantifierades de rekombinanta proteinerna med hjälp av Bradford-analysen och bekräftades genom färgning med Coomassieblått efter natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgelelektrofores (PAGE). DC101 (50 mg/kg) eller en lika stor mängd kontrollantikropp (IgG-Fc, SAB3700546, Sigma-Aldrich) injicerades i.p. i de angivna mössen varannan dag i två veckor.

Intestinal LEC-anrikning och IntSC-isolering från tunntarmen

Serosa, muskelskiktet och mesenteriala fettvävnader avlägsnades från tunntarmen. Efter att ha öppnat tarmfragmenten på längden och tvättat dem med PBS skars proverna i 2 cm långa bitar och Peyer’s patches avlägsnades. Proverna tvättades med PBS och inkuberades med 10 mM EDTA med kalcium- och magnesiumfri DMEM (Gibco) på is i 20 minuter. Vävnaderna vortexades med kalciumfri PBS tills man fick en klar supernatant som var fri från epitelceller. Provbitarna skars vidare i 1 mm stora fragment och dissocierades med dissociationsbuffert som innehöll 2 mg/ml kollagenas II (Worthington), 1 mg/ml dispas (Gibco) och 1 U/ml DNas (Invitrogen) i DMEM vid 37 °C i 30 minuter. För att underlätta dissociationen pipetterades vävnadsdelarna försiktigt upp och ner var 10:e minut. Proverna filtrerades sedan genom en 70 μm sil för att mekaniskt sönderdela de återstående tarmfragmenten. Efter att ha samlat upp supernatanten tillsattes en lika stor volym DMEM med 10 % fetalt bovint serum (FBS). Efter centrifugering återuppsattes cellerna i PBS. För att anrika stromalcellsfraktionen och LECs utplöts hematopoetiska celler och epitelceller med AutoMACS (Miltenyi) efter inkubation i 15 minuter på is med anti-CD45- och anti-CD326-mikrokulor (Miltenyi). För IntSC-isolering tillsattes anti-CD31 Microbeads (Miltenyi) för att utplåna endotelceller utöver anti-CD45 och anti-CD326 Microbeads.

Primärodling av IntSC från mus

Efter isolering av IntSC odlades cellerna med DMEM/F12 innehållande 10 % FBS på en vävnadskulturplatta i 24 timmar eller 2 dagar. För läkemedelsbehandlingar och immunofluorescensfärgning placerades 50 000 celler per brunn på Nunc Lab-Tek II-kammarglas med 4 brunnar (Sigma-Aldrich). Läkemedelskoncentrationerna beskrivs i de angivna bildtexterna och behandlingarna varade 6 timmar för immunofluorescens- och genuttrycksanalys. En 35 mm avbildningsskål med elastiskt stödd yta (Ibidi) användes för IntSC-kultur på mjuka (1,5 kPa) och styva (28 kPa) matriser under 24 h. För induktion av cre-aktivitet i primärt odlade IntSC som härstammar från WT- eller Yap/Tazi∆FRC-möss, behandlades cellerna med 5 µM 4-hydroxitaxifen (4-OHT) i 100 % etanol (EtOH) eller enbart 100 % EtOH i 2 dagar som en kontroll. Kultur-expanderade monolager av IntSCs som validerades som PDGFRβ+ användes för experimenten.

Flödecytometri och cellsortering

För att sortera PDGFRβ+ IntSCs eller intestinala LECs gick de berikade fraktionerna på RBC-lys genom suspension i ACK-lysisbuffert (Gibco) i 5 min vid RT. Efter blockering av Fcγ-receptorer med mus anti-CD16/CD32 (553141, BD Bioscience) inkuberades cellerna i 15 min med angivna antikroppar i FACS-buffert (2 % FBS i PBS). Efter flera tvättar analyserades cellerna med FACS Canto II (BD Biosciences) och de insamlade uppgifterna utvärderades ytterligare med hjälp av programvaran FlowJo (Treestar). Cellsortering utfördes med FACS Aria Fusion (Beckton Dickinson). Döda celler uteslöts med hjälp av DAPI-färgning (Sigma-Aldrich) och celldubbletter uteslöts systematiskt. Fluorescensintensiteten uttrycks i godtyckliga enheter på en logaritmisk skala, och framåtspridning och sidospridning representeras på en linjär skala. Följande antikroppar användes för flödescytometri: FITC-antimus CD45 (11-0451-85, monoklonal råtta, Biolegend), FITC-antimus TER-119 (11-5921-85, monoklonal råtta, Biolegend), APC-antimus CD31 (551262, monoklonal råtta, BD Bioscience) och PE/Cy7-antimus Podoplanin (127412, monoklonal monoklonal syriansk hamster, Biolegend).

Bulk RNA-sekvensering

Bulk RNA-sekvensering av de isolerade PDGFRβ+ IntSCs utfördes genom att erhålla anpassningsfilen. I korthet kartlades läsningar med hjälp av programvaruverktyget TopHat. Anpassningsfilen användes för att sammanställa transkript, uppskatta deras abundans och upptäcka differentiellt uttryck av gener eller isoformer med hjälp av cufflinks. Verktyget Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) användes för att ytterligare utvärdera data i samband med kanonisk signalering och fastställa om YAP/TAZ-hyperaktiverade gener var specifikt relaterade till de sekretoriska molekylerna. Betydelsen av den kanoniska signaleringen testades med Benjamini-Hochberg-proceduren, som justerar P-värdet för att korrigera för multipla jämförelser, och deras aktivering eller hämning fastställdes med hänvisning till aktiveringens z-scores. Klusteranalys och värmekartor genererades med hjälp av Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus/). För GSEA användes genuppsättningar från Molecular Signatures Database 4.0 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/).

MEFs och HDLECs

Musembryonala fibroblaster (MEFs) isolerades från E12,5 embryon enligt tidigare beskrivning32. I korthet avlägsnades vävnader från huvud, lemmar och hjärta och proverna hackades sönder med sax och smältes med 0,1 % trypsin/EDTA med DNas (1 U/ml, Invitrogen) vid 37 °C i 20 minuter. Efter digestion och avlägsnande av osmält vävnad snurrades cellerna kortvarigt, plattades ut på en 10 cm skål och lät dem växa till subkonfluens. MEF:erna hölls sedan i DMEM/F12 som innehöll 10 % FBS. Mänskliga dermala lymfatiska endotelceller (HDLEC) köptes från Lonza och odlades i endoteliala tillväxtmedium (EGM2-MV, Lonza). MEFs och HDLECs användes vid passage 2 eller 3. Cellerna inkuberades i en befuktad atmosfär med 5 % CO2 vid 37 °C och det bekräftades att de var mykoplasmanegativa (MycoAlert Detection Kit, Lonza).

Sfäroidbaserad groddförsök

LEC-sfäroider genererades genom att odla HDLEC vid passage 2 eller 3 i odlingsmedium som innehöll 0,25 % metylcellulosa och inkuberades över natten som hängande droppar36. Spheroiderna samlades sedan upp och bäddades in i 2 mg/ml kollagen typ I (Corning), behandlades med kontroll bovint serumalbumin (BSA, Sigma-Aldrich), WISP2 (300 ng/ml, Peprotech), TNFSF15 (50 ng/ml, Peprotech), BDNF (50 ng/ml, Peprotech), EBI3 (100 ng/ml, Peprotech) eller ANGPT2 (5 μg/ml, egentillverkat) med eller utan VEGF-C (200 ng/ml, R&D Systems) i Endothelial Cell Basal Medium (PromoCell) innehållande 1 % FBS i 24 timmar. I slutet av inkuberingen färgades spheroiden med cell tracker (Molecular Probes, 1,5 μM, 37 °C, 30 min). Spheroiderna fixerades sedan i 4 % PFA i 15 minuter vid RT och avbildades med hjälp av Cell observer (Carl Zeiss).

Kvantitativ RT-PCR

RNA extraherades med hjälp av RNeasy Micro kit (Qiagen) eller Trizol RNA-extraktionskit (Invitrogen). Totalt 1 µg extraherat RNA transkriberades till cDNA med GoScript Reverse Transcription Kit (Promega). Kvantitativ PCR i realtid utfördes med FastStart SYBR Green Master mix (Roche) och S1000 Thermocycler (Bio-Rad) med de angivna primrarna. Primerna utformades med hjälp av Primer-BLAST eller övertagits från tidigare publicerade studier, vilka beskrivs i kompletterande tabell 1. Gapdh användes som referensgen och resultaten presenterades som relativa uttryck i förhållande till kontroll. Primerreaktionens specificitet bekräftades genom smältkurvanalys. Relativt genuttryck analyserades med ΔΔCt-metoden med hjälp av programvaran CFX Manager (Bio-Rad).

In vitro-sträcknings- och osmotiska experiment

MEFs och primära IntSCs från musen sträcktes med hjälp av ett mekaniskt cellsträckningsinstrument (STREX) med 4 % linjär sträckning vid 10 cykler/min, och osmotisk stress applicerades med 0,4 M sorbitol i 3 timmar enligt tidigare beskrivning40,50. Cellerna hölls i en befuktad 5 % CO2-inkubator vid 37 °C under alla experiment.

Ex vivo osmotiska experiment

Efter att ha öppnat bukhålan under anestesi skars jejunumdelen av tunntarmen i 2 cm långa bitar. Tarmfragmenten öppnades i längsled och tvättades med PBS. Vävnaderna odlades sedan i DMEM/F12 med 5 % FBS och osmotisk stress applicerades omedelbart med 0,4 M sorbitol i odlingsmediet under 3 timmar. Vävnaderna förvarades i en befuktad inkubator med 5 % CO2 vid 37 °C under alla experiment.

Immunofluorescensfärgning av MEFs

MEFs plattades ut på Nunc Lab-Tek II-kammarglas med 8 hål (Sigma-Aldrich) och fixerades med 4 % paraformaldehyd i 15 minuter vid 4 °C. Efter flera tvättar med PBS blockerades proverna med 5 % get- (eller åsne-) serum i 0,5 % PBST i 30 minuter vid RT. Cellerna inkuberades med de angivna primära antikropparna vid 4 °C över natten. Bindning av primära antikroppar påvisades genom inkubering med sekundära antikroppar i 90 minuter vid RT. Följande primära antikroppar användes för cellfärgning: anti-YAP (kaninmonoklonal, 14074, Cell signaling), anti-TAZ (kaninpolyklonal, HPA007415, Sigma-Aldrich) och Alexa Fluor 488-konjugerade anti-falloidin-antikroppar (A12379, Thermo Fisher). Alexa Fluor 594-konjugerade sekundära antikroppar köptes från Jackson ImmunoResearch. Kärnor färgades med DAPI (Invitrogen) och objektglas monterades och avbildades enligt ovan.

ChIP-qPCR

MEFs fixerades med 1 % PFA i 10 minuter och släcktes med glycin. Proverna tvättades med PBS och lyserades med lysisbuffert innehållande 1 % SDS. Det fixerade DNA:t i celllysaten sonicerades med hjälp av Focused-ultrasonicator (Covaris). Celllysaten centrifugerades och alla utom 5 % (sparades för kontroll av inmatning av helcellslysat) av de resulterande supernatanterna späddes ut med ChIP-spädningsbuffert som innehöll 0,5 % Triton X-100. Utspädda prover inkuberades sedan över natten vid 4 °C med anti-TEAD4-antikropp (musmonoklonal, ab58310, Abcam). Därefter tillsattes protein A/G Dynabeads (Thermo Fisher) och proverna inkuberades i 2 timmar vid 4 °C. Pärlorna isolerades med DynaMag-2 (Thermo Fisher), tvättades med serier av ChIP-tvättbuffertar: tvättbuffert med låg salthalt, tvättbuffert med hög salthalt, LiCl-tvättbuffert och TE-buffert. Proverna eluerades i 1 % SDS två gånger i 15 minuter vardera vid 65 °C. Pärlorna avlägsnades och både det eluerade materialet och 5 % av insatsproverna från helcellslysat tvärbindades omvänt över natten vid 65 °C. Efter normalisering av pH-värdet inkuberades proverna i 30 min med RNas (3 μg/ml) vid 37 °C och i 2 h med proteinas K (20 mg/ml) och glykogen (20 mg/ml) vid 55 °C. DNA eluerades med hjälp av standardprocedurer och ChIP-DNA analyserades med qPCR jämfört med insatsproverna med hjälp av de primers som anges i kompletterande tabell 2.

ELISA

Supernatanten av primärodlade musintSCs i musodling skördades efter sträckning, och supernatanten centrifugerades i 15 minuter. Koncentrationen av VEGF-C i supernatanten mättes genom enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) med mus VEGF-C-specifikt ELISA-kit (CSB-E07361m, Cusabio).

Morfometrisk analys

Morfometriska mätningar utfördes med hjälp av programvaran ImageJ (NIH), programvaran ZEN 2012 (Carl Zeiss) eller Imaris (Bitplane). För kvantifiering av laktusytan ställdes ett tröskelvärde in för de bilder som skulle analyseras och den absoluta villus LYVE-1+-ytan mättes för varje laktus inom villus. Den absoluta laktallängden, den absoluta villlängden och den absoluta villibredden mättes med hjälp av bilder av immunfärgning av E-cadherin+ eller CD31+ eller LYVE-1+ i var och en av de slumpmässiga 850 µm2-fälten i den angivna delen av tarmen. För kvantifiering av laktus- och villiyta, längd och bredd analyserades minst 100 villi längs hela tunntarmen. Kvantifiering av följande parametrar i tunntarmen utfördes i jejunum. Antalet laktusskott och antalet laktusförgreningar mättes i 10-20 slumpmässiga LYVE-1+ laktus. Antalet Prox1+ LECs och antalet Prox1+EdU+ LECs räknades manuellt inom 100 μm längd av 10-20 slumpmässiga LYVE-1+ laktat. Kvantifiering av VE-cadherin+-övergångar i laktat utfördes med ×40-objektiv i laktat av 5-10 villi per mus. Kortfattat definierades en förbindelse av dragkedjetyp som kontinuerliga förbindningar vid cell- och cellgränserna med celler som har en långsträckt form51. Knappliknande förbindelse definierades som diskontinuerliga förbindningar som inte är parallella med cell-cellgränserna och ekbladliknande cellform. Sammanfogningar som inte motsvarar något av mönstren kategoriserades som blandade typer. Fluorescensintensiteten (FI) för BODIPY och dess kvantifiering utfördes enligt tidigare beskrivning34. Oljeröd O-yta mättes som oljeröd O+-yta dividerat med villusyta och normaliserades med genomsnittet av dem hos kontrollmöss. Villus glatta muskelcellers täckningsområde mättes som absolut αSMA+ täckningsområde i fem 850 µm2 fält per prov, som sedan normaliserades med genomsnittet av dem hos kontrollmöss. För att kvantifiera de relativa uttrycken av lakteal VEGFR3 mättes genomsnittlig FI i fem 425 µm2 fält per prov och presenterades som relativa värden dividerat med dess kontroll. För att bestämma blodkärlstätheten mättes arean av VEGFR2 i fem fält på 425 µm2 per prov och presenterades som relativa värden i förhållande till kontrollen. Arealen av CD3+ T-celler eller F4/80+ makrofager mättes i fem 425 µm2 fält per prov. Tätheten av lymfatiska kärl beräknades genom att mäta LYVE-1+-ytan i fem slumpmässiga fält på 425-850 µm2 från helmonterade prover och presenterades som relativa värden i förhållande till dess kontroll.

Dropletbaserad RNA-sekvensering av encelliga celler

Sorterade encelliga celler bearbetades med hjälp av 10X Chromium Single cell 3′ Reagent Kit v3 (10X genomics) enligt tillverkarens protokoll. Kortfattat: sorterade celler resuspenderades i PBS med 0,5 % BSA och blandades med RT-reagensblandning och RT-primer, som sedan tillsattes till varje kanal i 10X-chipen, med 5 000 celler som målgrupp. Cellerna separerades i gelpärlor i emulsion där RNA-transkriptioner från enskilda celler barkodades och omvänt transkriberades. Efter konstruktion och amplifiering av cDNA-bibliotek fragmenterades cDNA-molekylerna enzymatiskt, reparerades i slutet och fick en A-tailed. Efter att ha valt lämplig storlek på de bearbetade cDNA-molekylerna genom dubbelt storleksurval med hjälp av SPRI-pärlor (Beckman Coulter), ligerades de med en adapter och PCR med provindex utfördes. Efter ytterligare ett dubbelstorleksurval med hjälp av SPRI-pärlor späddes de slutliga bibliotekskonstruktionerna 10 gånger och kördes på Agilent Bioanalyzer High Sensitivity Chip för kvalitetskontroll. Encellsbibliotek sekvenserades sedan med hjälp av Illumina HiSeq-X-plattformen.

Förbehandling av RNA-data från enskilda celler

Rå sekvenseringsdata de-multiplexerades först och kartlades till musens referensgenom (mm10) med hjälp av Cell Ranger 3.0.2 toolkit från 10X Genomics (http://10xgenomics.com). Med hjälp av R-paketet Seurat (version 3.0.0.0)52 byggdes råa uttrycksmatriser upp med hjälp av Read10X-funktionen. Celler med färre än 1 000 detekterade gener eller fler än 6 000 detekterade gener (som betraktades som potentiella dubbletter) uteslöts (kompletterande figur 17a). Dessutom betraktades celler med höga antal mitokondriella genassocierade unika molekylära identifierare (UMI) (>7 % av det totala antalet) som döda celler och exkluderades därför. När det gäller gener togs de gener bort som uttrycktes av färre än tre celler. Dessutom exkluderades ett litet antal kontaminerande Ptprc+ immunceller och Pecam1+ Cdh5+ endotelceller efter den första klusteromgången. Efter att oönskade celler och gener tagits bort dividerades UMI-räkningar för varje gen för en cell med det totala uttrycket för en viss cell och multiplicerades med 10 000 och log-transformerades. Därefter skalades och centrerades generna genom att regressera ut variabler som mitokondriell genprocent och antal UMI.

Identifiering av variabla gener och dimensionalitetsreducering

R-paketet Seurat användes för klusteranalys. Först identifierades mycket variabla gener i hela datasetet med hjälp av funktionen FindVariableFeatures i Seurat med alternativet: selection.method = ”vst”. De 2000 generna med högst variabilitet valdes ut för analys i efterföljande led. Med hjälp av de identifierade variabla generna utfördes inledande dimensioneringsminskningar med hjälp av huvudkomponentanalys (PCA). JackStraw-funktionen användes för att fastställa den statistiska betydelsen av PCA-poängen. De mest signifikanta 30 huvudkomponenterna (PC) användes som indata för Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) för att reducera data till ett tvådimensionellt utrymme.

Klusteranalys

För att klustra celler efter deras transkriptionsprofiler utförde vi en oövervakad klusterbildning på de 2000 mest variabla generna för alla fyra proverna. Vi byggde först en SNN-graf (shared nearest neighbors) på huvudkomponentutrymmet med hjälp av FindNeighbors-funktionen. Sedan tillämpade vi Louvain-algoritmen för modularitetsoptimeringsbaserad klustring med hjälp av funktionen FindClusters. Parametrarna för klusterupplösning ställdes in vid den punkt där klustren uppvisade mycket distinkta transkriptionsprofiler. Klusterbildningarna var oberoende av antalet upptäckta gener per cell (kompletterande figur 17b). Klusterspecifika markörer var differentiellt uttryckta gener för varje kluster som identifierades genom FindMarkers-funktionen i Seurat med följande inställningar: min.pct = 0,3, logfc.threshold = 0,25, min.diff.pct = 0,15,test.use = ”MAST”. Identifierade markörer med justerad P < 0,05 användes för vidare analys. Eftersom vissa celltyper, t.ex. glatta muskelceller och murala celler, hade välkända markörer, validerade deras utseende högst upp i markörlistan för varje kluster våra markörvalsprocesser. För att avlägsna oönskade källor till variationer, t.ex. kön, delades cellerna upp efter förekomst av det kvinnospecifika transkriptet Xist och integrerades. För att integrera olika dataset log-normaliserade vi först varje rå uttrycksmatris och identifierade de 2000 mest varierande generna för varje dataset. Med hjälp av funktionen FindIntegrationAnchors i Seurat identifierade vi sedan ankare mellan dataseten. Därefter integrerades datamängderna på grundval av de identifierade ankarna med hjälp av funktionen IntegrateData i Seurat. De integrerade datamängderna skalades sedan och dimensionerna reducerades för vidare klusteranalys. Kluster i de integrerade datamängderna annoterades genom deras uttrycksprofiler för gener i de identifierade makerlistorna.

Genontologisk anrikningsanalys

Genontologisk anrikningsanalys på klustermarkörerna utfördes med hjälp av R-paketet goseq (version 1.34.0)53. Beroende på genens längd erhölls viktningar för varje gen och Wallenius approximation användes för att identifiera associerade termer i genontologin. Gene ontologitermer som har justerad P < 0,05 och biologiska processkategorier valdes ut.

Statistik

Ingen statistisk metod användes för att förutbestämma urvalsstorleken. Experimenten var randomiserade och utredarna var blinda för tilldelningen under experimenten och resultatanalyserna. Alla värden presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Statistisk signifikans fastställdes med det tvåsidiga Mann-Whitney U-testet mellan två grupper eller tvåvägs ANOVA med Holm-Sidaks multipeljämförelsetest för jämförelse mellan flera grupper. Statistiska analyser utfördes med hjälp av GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software). Statistical significance was set at P < 0.05.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.