1 Teori
Oligonukleotider syntetiseras genom tillsats av en bas i taget, som sträcker sig från 3′- till 5′-ändan och som är fäst vid ett fastfasstöd. När den kemiska syntesen av oligonukleoiden är klar frigörs DNA-kedjan från det fasta stödet genom inkubation med ammoniumhydroxid. Ammonium fungerar också som ett avprotektivt medel, genom att det avlägsnar de grupper som skyddar fosfaterna i fosfodiesterbindningarna. Därefter tillsätts varm ammoniak för att hydrolysa skyddsgrupperna från de exocykliska aminogrupperna i deoxyadenosin, deoxycytosin och deoxyguanosin. Oligonukleotiden kan levereras till användaren i ammoniaklösningen som ett råpreparat. I detta fall kan det före användning vara nödvändigt att utföra ett ytterligare steg för att avlägsna de salter och biprodukter från oligonukleotidpreparatet som genereras under avprotektionen.
Efter avprotektionen avsaltas oligonukleotidpreparatet vanligen, kvantifieras, avdunstar till torrhet i en lyofiliserare och levereras till användaren i form av ett pulver. Den avsaltade oligonukleotidlösningen innehåller den fullständiga oligonukleotiden men också en blandning av trunkerade produkter som ackumulerats under den kemiska syntesen. Trunkering uppstår när den angivna basen inte lyckas lägga till kedjan i motsvarande cykel (Hecker & Rill, 1998). Procentandelen trunkerade produkter som ackumuleras i preparatet bestäms således av syntesens effektivitet (fraktionen av fullängdsprodukt efter syntesen) och molekylens längd. Långa oligonukleotider, som kräver fler cykler för att syntetiseras, är mindre rena än korta oligonukleotider. Dessa fel kan konkurrera med den fullständiga produkten i vissa tillämpningar och kan behöva avlägsnas innan oligonukleoiden kan användas. Avsaltade oligonukleotidpreparat är dock vanligtvis lämpliga för många tillämpningar, t.ex. standard-PCR eller mikroarrayer, särskilt om oligonukleotiden är < 20 nukleotider lång.
Förlängre rening av oligonukleotider som är längre än 50 baser rekommenderas, eftersom procentandelen av fullängdsprodukt i preparatet vanligtvis inte är högre än 80 %. För krävande tillämpningar där oligonukleotilens exakta längd är viktig, t.ex. gel-shift-analyser, platsstyrd mutagenes, sekvensering, framställning av kloningsadaptrar eller syntes av första strängens cDNA för generering av bibliotek, rekommenderas ytterligare rening, även för kortare oligonukleotider (se mer information om teknikerna ovan om Standard in vitro-analyser för interaktioner mellan proteiner och nukleinsyror – gel-shift-analyser för RNA- och DNA-bindning och platsstyrd mutagenes).
Rensning kan krävas efter syntes eller efter enzymatisk modifiering av oligonukleoiden. Det finns flera metoder för att uppnå detta, och valet beror på oligonukleotilens karaktär och den tillämpning som den är avsedd för.
Rensning med HPLC i omvänd fas bygger på hydrofobicitet. Den använder en opolär stationär fas och vattenbuffertar och organiska lösningsmedel som rörlig fas för att eluera analyterna; polära föreningar elueras först, medan opolära föreningar kvarstår. Detta är den bästa metoden för rening av oligonukleotider som modifierats med en hydrofob grupp, t.ex. biotin, fluorescerande färgämnesmärken eller NHS-esterkonjugationer. Massåtervinningen är högre än vid användning av PAGE-rening och metoden lämpar sig för rening av större mängder oligonukleotider (mmolekylskala), även om den inte avlägsnar ofullständiga produkter lika effektivt. Oligonukleotidreningspatroner, som bygger på kromatografi i omvänd fas, är en snabb metod för avsaltning och rening av oligonukleotider.
Polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) löser upp oligonukleotider i enlighet med deras längd och erbjuder därmed tillräcklig upplösning för att skilja fullängdsprodukter från misslyckade molekyler (Atkinson och Smith, 1984). Polyakrylamidgeler är effektivare för att separera små DNA-fragment än agarosgeler (se Analys av RNA genom analytisk polyakrylamidgelelektrofores och Agarosgelelektrofores). Den enda nackdelen med polyakrylamidgeler är att de är svårare att förbereda och hantera än agarosgeler. Polyakrylamidgeler körs i en vertikal konfiguration i ett konstant elektriskt fält. Efter elektroforesen elueras oligonukleotiden från gelen och koncentreras med hjälp av etanolfällning (mer information om fällning av nukleinsyror finns på RNA-rening – fällningsmetoder) eller kromatografi i omvänd fas. Detta är den metod som väljs när den högsta procentandelen oligonukleotider i full längd önskas för krävande tillämpningar. Den rekommenderas också starkt för oligonukleotider som är längre än 30 baser. Dessutom kan flera prover köras samtidigt och ingen dyr utrustning krävs. Den enda nackdelen med denna teknik är den lilla mängd oligonukleotid som erhålls per rening. Vanligtvis används oligonukleotider i en skala på 1 μmol eller mindre, och massåtervinningen efter PAGE-rening är < 50 % och ännu lägre när det gäller modifierade oligonukleotider. Även om utbytet är lågt är det dock tillfredsställande för de flesta biokemiska tillämpningar.
Oligonukleotidpreparatet laddas på en denaturerande polyakrylamidgel i en mängd på minst 1 mg per körfält. Gelens upplösningsområde beror på koncentrationen av polyakrylamid. För korta oligonukleotider (från 15 till 35 baser) rekommenderas 13-15 % polyakrylamidgeler; för längre oligonukleotider (från 35 till 70 baser) rekommenderas 8-13 % polyakrylamidgeler. Procentandelen av gelen bör anpassas till körsystemet. Vi använder vanligtvis Bio-Rad Mini Protean II-systemet och kör 15 % geler för att rena oligonukleotider med en längd på 25 baser. Efter identifiering av rätt band genom UV-visualisering excideras bandet och extraheras från gelen.
Två olika metoder för att rena oligonukleotider från polyakrylamidgeler beskrivs i detta kapitel. Den enklaste metoden är eluering med hjälp av diffusion. Denna bygger på att molekyler rör sig från ett område med högre koncentration till ett område med lägre koncentration. Resultatet av diffusionen är en gradvis blandning av materialet. Denna metod är tidskrävande men kräver inte alltför mycket arbete eller någon utrustning. I princip skärs polyakrylamidbandet som innehåller den intressanta oligonukleotiden i små bitar och täcks med elutionsbuffert. Efter inkubation renas DNA:t från supernatanten genom etanolfällning. Utbytet är begränsat, mellan 20 och 70 %, beroende på oligonukleotilens längd. Ju större mängd elutionsbuffert som används, desto mer oligonukleotid diffunderar från gelen.
Den andra metoden är elektroelution i en dialyspåse (McDonell et al., 1977). Gelbiten som innehåller oligonukleotiden skärs ut och placeras i en dialyspåse med en buffert. Genom att applicera en elektrisk ström får DNA:t att vandra ut ur gelen och in i dialyspåsebufferten. Oligonukleotiden återvinns från denna buffert och renas. Med denna metod kan oligonukleotiden isoleras med god avkastning, även om den är tidskrävande om ett stort antal prover renas samtidigt, eftersom den kräver att varje gelband sätts in i enskilda dialyspåsar. Denna metod fungerar också bra för större DNA-fragment och kan även användas för att extrahera DNA från agarosgeler.