Huvudtext
Den mänskliga Y-kromosomen överförs direkt från far till son under större delen av sin längd, vilket genererar ett mansspecifikt arvsmönster som skiljer sig från resten av arvsmassan. Y-kromosomala fenotypiska egenskaper bör därför lätt kunna kännas igen från deras manliga arv, och tidiga studier hävdade att flera sådana egenskaper kunde identifieras, inklusive anmärkningsvärda exempel som ”håriga öron”. Redan 1957 misslyckades dock en kritisk granskning av dessa påståenden med att finna stöd för någon av de 17 egenskaperna i fråga,1 ett resultat som förstärktes av en senare molekylärgenetisk analys av själva ”håriga öron”.2 Denna kanske överraskande brist på Y-kromosomala egenskaper kan åtminstone delvis förstås som en följd av två faktorer. För det första, när en referenssekvens för den manliga specifika regionen av människans Y-kromosom genererades 20033 , visade det sig att kromosomen bär på få manliga specifika gener och kodar för endast 23 olika proteiner. Senare arbete har visat att tre av dessa saknas hos cirka 2 % av de sydasiatiska männen, vars Y-kromosomer således kodar för endast 20 manliga specifika proteiner.4 För det andra har Y-kromosomen specialiserade funktioner i den manliga könsbestämningen och fertiliteten, där det är osannolikt att mendelsk variation skulle vara ärftlig. I början av 2004 var det därför möjligt att skriva ”stamträdsanalyser har ännu inte avslöjat en enda Y-bunden gen”.5 Senare samma år rapporterades dock Y-bunden hörselskada (DFNY1, MIM 400043) i en kinesisk familj6 och förblir den enda dokumenterade mendelska sjukdom som uppvisar Y-bindning hos människor. Dess grund verkar därför sannolikt vara ovanlig och är av stort intresse. Här undersöker vi denna grund genom att undersöka sekvensen av DFNY1:s Y-kromosom och jämföra den med Y-kromosomen hos en närbesläktad men opåverkad gren av familjen.
I den DFNY1-stamtavla i sju generationer som rapporterades 2004 var alla vuxna män påverkade.6 Därefter spårades stamtavlan ytterligare två generationer bakåt, och ytterligare manliga ättlingar till en tidigare förfader identifierades.7 Det slående är att deras hörsel var opåverkad (figur 1). Vi hade tidigare visat att Y-kromosomerna från de två grenarna av familjen var identiska vid 67 Y-STR loci, och vi resonerade därför att den fenotypiska skillnaden mellan grenarna måste vara förknippad med en genetisk variant som bärs specifikt av Y-kromosomen i den drabbade grenen. Vi sorterade en representativ Y-kromosom från varje gren med flödescytometri och sekvenserade den sedan. Endast fyra bas-substitutionella skillnader identifierades mellan kromosomerna.8 Tre av dessa hade uppstått på den opåverkade grenen. Den fjärde hade uppstått på den drabbade grenen och segregerades med fenotypen, men den var en dålig kandidat för den orsakande mutationen eftersom den låg utanför någon annoterad gen. Även om denna analys inte kunde utvärdera de upprepade regionerna av kromosomen, är de kända upprepade generna huvudsakligen involverade i spermatogenesen,3,9 så i den aktuella studien har vi undersökt möjligheten att den orsakande mutationen kanske inte är en punktmutation. Denna studie godkändes av provgivarna, som gav skriftligt informerat samtycke, och av kommittén för medicinsk etik vid Chinese PLA General Hospital, Beijing, Kina.
Det DFNY1 stamtavlan
Hannar, fyrkanter; kvinnor, cirklar; diagonal linje, avlidna. Fyllda symboler anger hörselskador (även från familjejournaler); frågetecken anger två individer vars hörselfenotyp är okänd; och asterisker anger individer som finns på den drabbade grenen men som vid undersökningstillfället var under den ålder då symtomen började uppträda. Pilar anger de två individer vars Y-kromosomer sekvenserades. Den strukturella omläggningen inträffade under en av de fyra meioser som är markerade med röda stjärnor. Makar är utelämnade i generationerna VII-IX och i generation VI på den opåverkade grenen.
Vi undersökte det relativa läsdjupet längs kromosomen genom att anpassa högkvalitativa duplikatfiltrerade läsningar till chrY-referenssekvensen med hjälp av Sequence Search and Alignment by Hashing Algorithm 2 (SSAHA2)10 och genom att jämföra antalet läsningar per 10 kb bin mellan Y-kromosomerna från den drabbade individen VIII-2 (figur 1) och den opåverkade individen VII-24 (figur 1). Detta avslöjade tre diskontinuerliga segment som duplicerades i den drabbade kromosomen, och alla härstammade från den begränsade regionen mellan genklustret TSPY1 (MIM 480100) som slutar vid ∼9,3 Mb och den centromeriska luckan vid ∼10,1 Mb (figur 2A). Dessa duplikationer bekräftades genom konventionell oligonukleotidarray komparativ genomisk hybridisering (CGH) med en Agilent 1 miljon array som täcker hela genomet och en skräddarsydd NimbleGen 385K array som spänner över positionerna chrY: 2 000 000-10 715 000 (1 990 000-10 105 000 hg19) med hög (∼20 bp) upplösning (Figur 2B). Eftersom de omfattade en del av TSPY1-genklustret verifierade vi en ökning av antalet TSPY1-gener genom qPCR (tabell S1 i de kompletterande uppgifterna som finns tillgängliga online) och pulsed-field gelelektrofores (PFGE; figur S1). Dessa analyser visade att duplikationen delades av alla testade drabbade familjemedlemmar och saknades hos alla icke drabbade medlemmar och även att duplikationen låg i ett separat restriktionsfragment från det ursprungliga TSPY1-klustret och därmed inte var sammanhängande. Även om de kombinerade bevisen bekräftade en komplex duplikation av 9,3-10,1 Mb-regionen gav de ingen information om var de duplicerade sekvenserna hade infogats. Fluorescens in situ-hybridisering (FISH) i metafas med en TSPY1-sond visade en enda signal (visas inte), så vi använde fiber-FISH enligt tidigare beskrivning11 för högre upplösning. Y-kromosomala prober var BAC-kloner som spänner över större delen av ∼9,3-10,1 Mb av referenssekvensen: RP11-334D2 (inklusive TSPY1), RP11-182H20, RP11-155J5, RP11-160K17 och RP11-108I14 (inklusive centromeriska sekvenser). Resultaten (figur 2C) visade att den opåverkade kromosomen var organiserad på samma sätt som referenssekvensen, vilket kan sammanfattas som TSPY1-182H20-centromer. Däremot avbröts den drabbade kromosomen (figur 2D) inom 182H20-sekvensen för att åstadkomma organisationen TSPY1-partiell 182H20-gap-centromerisk duplikation-TSPY1-duplikation-182H20-centromere. Fiber-FISH-resultaten visade alltså att de duplicerade Y-sekvenserna återinfördes lokalt i en omarrangerad form, men de avslöjade också närvaron av ett segment som inte hybriderade med någon sond från TSPY1-centromer-regionen.
Karaktärisering av den strukturella omläggning som DFNY1:s Y-kromosom bär på
(A) Relativt avläsningsdjup (påverkad/icke påverkad) i 10 kb-bitar som kartläggs till Y-kromosomens referenssekvens mellan 9,3 och 10,1 Mb. Observera monteringsluckorna i varje ände av denna region.
(B) CGH log2-förhållande (påverkad/icke påverkad) för samma region.
(C) Fiber-FISH av de tre BAC-kloner som anges till den icke påverkade Y-kromosomen, vilket visar att den bär på referensstrukturen i denna region. Både 334D2 och 108I14 upptäcker tandemarrays som är större än BAC-klonens storlek.
(D) Fiber-FISH av samma BAC-kloner till den drabbade Y-kromosomen. Denna kromosom bär på en insertion som avbryter den 182H20-hybridiserande regionen och innehåller partiella duplikationer av både 334D2- och 108I14-hybridiserande sekvenser.
(E) Absolut avläsningsdjup av avläsningar från opåverkade och påverkade Y-kromosomer till 160.15-160,35 Mb-regionen i kromosom 1-referenssekvensen.
(F) CGH log2-förhållande (påverkad/icke påverkad) för samma kromosom 1-region.
(G) Metafas-FISH av kromosom 1 BAC-klon 179G5 på den opåverkade Y-kromosomen (gul). Hybridisering ses endast vid referensplatsen på kromosom 1.
(H) Metafas-FISH av samma kromosom 1-sond på den drabbade Y-kromosomen (gul). Hybridisering ses vid ytterligare ett lokus på Y-kromosomen.
(I) Fiber-FISH av de två angivna Y BAC-klonerna plus kromosom 1-klonerna 574F21, 179G5 och 1365F20 på den opåverkade Y-kromosomen. Ingen kromosom 1-signal upptäcks på Y.
(J) Fiber-FISH av samma kloner på den opåverkade Y-kromosomen. Kromosom 1-klonerna upptäcker en signal på Y mellan den partiella 182H20-signalen och 108I14-signalen. Genomkoordinater hänvisar till GRCh37/hg19.
För att identifiera dessa okända sekvenser utförde vi termisk asymmetrisk interlaced PCR (TAIL-PCR)12 på segmentet som sträcker sig från 182H20-brytningspunkten in i gapet med hjälp av de primers som visas i tabell S2. I på varandra följande amplifikationer kombinerar detta förfarande inbäddade primers som är specifika för den kända sekvensen med degenererade primers som förväntas primera i den okända flankerande sekvensen. Kandidatförgreningar känns igen eftersom deras storleksskillnader i på varandra följande reaktioner återspeglar de kända primerpositionerna. De angränsande sekvenserna, som bekräftats med brytpunktsspecifika primers (tabell S3 och figurerna S2 och S3), härrörde från kromosom 1 (160,16 Mb), och en undersökning av läsdjupet, CGH-profilerna (figurerna 2E och 2F) och sekvensen tydde på att det rörde sig om en sammanhängande region på ∼160 kb. En sådan inblandning stöddes av identifieringen av en andra, mer komplex kromosom 1-Y-övergång vid 160,32 Mb. Translokationen av kromosom 1-sekvenser till det drabbade Y bekräftades med metafas-FISH (figurerna 2G och 2H), och deras placering inom luckan i Y-duplikationen bekräftades med fiber-FISH (figurerna 2I och 2J) med BACs RP11-574F21, RP11-179G5 och W12-1365F20 från kromosom 1 som sonder. De kombinerade uppgifterna avslöjade således en komplex duplikationsstruktur som består av både ett kromosom 1-fragment och flera segment av Y-DNA (tabell S4 och figurerna S2 och S3). Ingen av de sekvenserade brytpunkterna uppvisade omfattande längder av homologi, men alla uppvisade mikrohomologi, ett mönster som indikerar FoSTeS (fork stalling and template switching), vilket är en mekanism som kombinerar disparata genomiska fragment under replikationen.13
Den duplicerade struktur som observerats här har inte rapporterats någon annanstans och måste ha uppstått under en av endast fyra meioser, vilket omfattar den meios under vilken DFNY1-mutationen i sig själv inträffade (figur 1). Det är därför troligt att den är kausal. De duplicerade Y-kromosomala sekvenserna kodar för endast ett känt protein, TSPY1, från en tandemordning av ∼10 TSPY1-gener, medan kromosom 1-sekvenserna bär på fem RefSeq-gener (CASQ1 , PEA15 , DCAF8 , PEX19 och COPA ) och 5′-ändan av en annan gen, NCSTN (MIM 605254) (exoner 1-3; figur 3). Mekanismer genom vilka duplikationen kan leda till dövhetsfenotypen omfattar en ökning av antalet genkopior, olämpligt uttryck till följd av nytt flankerande DNA, eller bildande av en förändrad produkt genom trunkering, fusion eller punktmutation. Inga expressionsdata finns tillgängliga från DFNY1-familjen, och inga nonsynonyma mutationer hittades i kromosom 1 RefSeq-generna (tabell S5). TSPY1-kopieringsantalet är polymorf inom befolkningen,14 och större antal TSPY1-kopior har hittats utan rapporterad dövhet, bland annat hos 47,XYY-individer; en studie förknippade högt TSPY1-kopieringsantal med en annan fenotyp, infertilitet.15 Ökat TSPY1-kopieringsantal ger således en dålig kandidat för dövhet. Däremot ligger kromosom 1-regionen helt och hållet inom ett cirka 900 kb stort intervall, DFNA49 (MIM %608372), som tidigare associerats med hörselnedsättning; den kausala mutationen i detta intervall är fortfarande okänd.16 Vi föreslår därför att samma gen eller gener kan ligga till grund för både DFNA49- och DFNY1-fenotyperna. Den mest förenklade mekanismen skulle vara doskänslighet hos en eller flera av dessa gener, så att ökat uttryck till följd av tre kopior leder till hörselnedsättning, även om andra mekanismer inte är uteslutna.
Struktur och geninnehåll i de opåverkade och påverkade Y-kromosomerna
(A) Strukturen hos den opåverkade (VII-24 i figur 1) Y-kromosomen. Grått och svart: fel respektive luckor i GRCH37-samlingen. Blå: region som matchar referenssekvensen på den upplösningsnivå som använts. Nedan visas en del av TSPY1-arrayen (blå pilspetsar) och platsen för de BAC-klonsignaler som identifierades i figur 2.
(B) Strukturen hos den drabbade (VIII-2 i figur 1) Y-kromosomen. Denna kromosom innehåller ett segment som inte finns i den opåverkade kromosomen; detta segment härrör från duplikationer av sekvenser från både kromosom 1 (gul) och Y-kromosomen (blå). Återigen visas geninnehållet och BAC-signalerna nedan. Pilspetsarna ovan visar de duplicerade segmentens orientering i förhållande till referenssekvensen.
(C) Detaljerad vy av de två kromosom 1-Y-övergångarna som studerats på sekvensnivå (figurerna S2 och S3), som visar skillnaden mellan den enkla strukturen i övergång 1 och den komplexa strukturen i övergång 2.
Vi fann att orsaken till den mänskliga Y-länkade mendelska störningen var förknippad med insättning av kromosom 1-sekvenser snarare än mutation av en Y-kromosomal gen. Detta stämmer överens med observationerna att varken duplicering (47,XYY-karyotyp) eller deletion (45,X-karyotyp) av hela Y-kromosomen och därmed av alla dess gener är förknippade med hörselnedsättning, vilket innebär att det är osannolikt att funktionsförlust eller duplicering av en Y-kromosomal gen ligger till grund för DFNY1-fenotypen. Omarrangemangets komplexitet är också förenligt med dess sällsynthet: Även om manlig linjedövhet borde vara en lätt igenkännbar fenotyp har så vitt vi vet endast en enda ytterligare familj med en liknande fenotyp rapporterats.17 Släktskapet mellan de två familjerna är okänt; den andra familjen är också kinesisk, men från en annan etnisk grupp (Tujia i stället för Han). De audiologiska egenskaperna är dock likartade, och på grundval av nuvarande kunskap är det omöjligt att utesluta ett gemensamt ursprung. Trots att detta specifika omarrangemang är sällsynt betraktar vi ändå förvärvet av autosomala sekvenser av Y-kromosomen som en vanlig del av den Y-kromosomala evolutionen, som vanligen är neutral och ibland når fixering, även om det i DFNY1-fallet är ofördelaktigt. Det är faktiskt anmärkningsvärt att Y-kromosomen bär på en fixerad insättning på ∼100 kb från den kromosomala regionen 1q43 i proximala Yq,18 nära DFNY1-insättningen. Denna observation väcker frågan om huruvida närheten i kärnan kan gynna DNA-överföring mellan dessa två kromosomer.19 Den föreslagna DFNY1-mutationsmekanismen, FoSTeS, har tidigare endast förknippats med intrakromosomala omarrangemang,13 så den aktuella studien utökar dess inflytande till att även omfatta interkromosomala omarrangemang; den belyser också behovet av en bättre förståelse för det försummade förhållandet mellan variation av kopianummer och hörselnedsättning.20