DNA-polymeras är ett viktigt biologiskt enzym som används vid DNA-replikation. I processen kopierar DNA till två dotter-DNA-molekyler och syntetiserar en ny DNA-sträng från den befintliga strängen genom att tillsätta dNTP:er till det växande DNA:t.
DNA-polymeraset har två avgörande roller i replikationen: 5′- till 3′-exonukleas-polymerasaktivitet och 3′- till 5′-exonukleas-provläsningsaktivitet. När polymeraset binder till DNA lägger det till nukleotid i riktningen 5′ till 3′.
Olyckligtvis är DNA-polymeras inte lämpligt för en typ av replikation som kallas polymeraskedjereaktion (PCR), eftersom det inaktiveras vid en högre temperatur. Taq DNA-polymeras spelar däremot en viktig roll i PCR.
Vad är Taq Polymeras?
Taq DNA Polymeras är ett mycket termostabilt rekombinant DNA-polymeras. Det är uppkallat efter Thermus aquaticus, den värmetoleranta bakterie från vilken det isoleras. Taq-polymerasets molekylvikt är 94kD, och det amplifierar DNA upp till 5kb med en förlängningshastighet på 0,9-1,2kb/min vid 70-75°C.
Vad är Polymerase Chain Reaction (PCR)?
Polymerase Chain Reaction, eller PCR, är en replikationsteknik som producerar många kopior av en specifik DNA-region in vitro (i ett provrör snarare än i en organism). PCR används inom olika områden av biologi och medicin, inklusive molekylärbiologisk forskning, medicinsk diagnostik och ekologi.
PCR bygger på Taq Polymeras, ett termostabilt DNA-polymeras. Den kräver också DNA-primers som är utformade specifikt för den aktuella DNA-regionen, samt mall-DNA och nukleotider (DNA-byggstenar).
I en PCR-reaktion samlar du de viktigaste ingredienserna i ett rör, tillsammans med kofaktorer som enzymet behöver. Ingredienserna genomgår upprepade cykler av uppvärmning och nedkylning som i slutändan syntetiserar DNA.
Det finns också tre grundläggande steg som du måste följa för att åstadkomma PCR, bland annat:
- Denaturering (96 °C): Värm reaktionen kraftigt för att separera, eller denaturera, DNA-strängarna.
- Glödgning (55-65 °C): Kyl reaktionen så att primrarna kan binda till sina komplementära sekvenser på det enkelsträngade mallen-DNA:t.
- Förlängning (72 °C): Höj reaktionstemperaturerna så att Taq-polymeraset förlänger primrarna och syntetiserar nya DNA-strängar.
Cykeln upprepar sig 25-35 gånger i en typisk PCR-reaktion, som i allmänhet tar 2-4 timmar, beroende på längden på den DNA-region som kopieras. Om reaktionen är effektiv kan målregionen gå från bara en eller några få kopior till miljarder kopior.
Taq Polymerasets roll i PCR
På grund av sin nyckelroll i syntesen och amplifieringen av nya DNA-strängar är Taq DNA Polymeras viktigt för Polymeraskedjereaktionen (PCR).
Likt andra DNA-polymeraser kan Taq Polymeras endast producera DNA om det har en primer, en kort sekvens av 20 nukleotider som ger en startpunkt för DNA-syntesen. Det är dock också ett termostabilt DNA-polymeras som kan arbeta vid högre temperaturer.
Taq DNA-polymeras är mycket effektivt, så det blir fullt fungerande när det når sin optimala temperatur. Det har också en halveringstid på mer än två timmar (vid en temperatur på 92 °C), en hög amplifieringskapacitet och förmågan att lägga till 150 nukleotider per sekund.
Välj G-Biosciences för dina PCR Essentials
På G-Biosciences erbjuder vi en mängd olika kit och produkter för dina PCR- och Taq DNA-polymerastillämpningar. För att göra din beställning, besök vår webbplats idag.