U.S. Food and Drug Administration

ITG SUBJECT: PYROGENS, STILL A DANGER

Introduktion

Med tillkomsten av den hypodermiska nålen fanns det en ny väg att administrera läkemedel. \Men med dagens mått mätt var de tidiga parenterala läkemedlen grova och osäkra, eftersom den ökade användningen av dessa tidiga injektionslösningar medförde infektioner, biverkningar, feber av okänd etiologi och till och med dödsfall på grund av chock. Det var förbryllande för de tidiga mikrobiologerna att sporadisk feber uppstod till och med vid injektion av sterila lösningar.

De moderna injektionslösningarna är säkrare, men i litteraturen \2\ fortsätter man att rapportera om biverkningar. I det här numret delar vi med oss av oron för den patient som inte kan ta vätska genom munnen på grund av kirurgi eller vissa typer av sjukdomar, och som kan drabbas av konsekvenserna av oönskade toxiner som är kända för att vara feberframkallande ämnen, om de finns i den parenterala produkten. Vi hoppas kunna visa nytta av vad man lärt sig på detta område.

Historiskt – Pyrogener

Det var känt under senare delen av 1800-talet att vissa parenterala lösningar orsakade en markant höjning av kroppstemperaturen. De feberframkallande ämnena var inte kända. Sjukdomar som berodde på denna ”febernatur” beskrevs på olika sätt som ”injektionsfeber”, ”feber med destillerat vatten”, ”saltvattenfeber” och ”saltvattenfeber”, bland andra benämningar. I dag erkänns bakteriella pyrogener \b)\ som det orsakande agens som är ansvarigt för många av dessa tidiga feberfall och för många av de andra biologiska effekter som beskrivs som tillfälliga i samband med parenteral behandling. Utifrån detta kan vi förstå varför man måste vara ytterst försiktig vid beredning och användning av injektionslösningar för att utesluta den smygande pyrogenen.

Naturligt försvar och pyrogener

Som friska människor som utsätts för en universell fördelning av mikrober i miljön, samexisterar vi med den mikrobiella världen. Normalt begränsar kroppens naturliga försvar mikroberna och deras metaboliter (toxiner etc.) till områden där de kan tolereras, t.ex. på huden och i matsmältningskanalen. Den parenterala administreringsvägen för ett läkemedel gör det möjligt för en eventuell pyrogen substans att kringgå kroppens normala försvar. Värdens reaktion förmedlas genom leukocyter (vita blodkroppar) som i sin tur släpper ut sin egen typ av pyrogen (endogent pyrogen) och detta i sin tur initierar feberreaktionen och en mängd andra biologiska reaktioner.

Biologiska effekter av endotoxiner

Den stora variation av biologiska effekter som tillskrivs bakteriella pyrogener har väckt stort intresse. \3\, \4\ Värdens reaktioner på pyrogener förväntas vara i följande kategorier: 1) feberproduktion, 2) chock och 3) förändringar i fysiologiska funktioner.

Fiber är en välkänd effekt, därav termen ”pyrogen”. Ungefär en timme efter injektion av pyrogener i kaniner (eller människor) sker en höjning av kroppstemperaturen. När bakteriella pyrogener injiceras i tillräckliga mängder, kanske i mikrogram, åtföljs den feber som produceras av frossa, värk i kroppen, en höjning av blodtrycket och eventuellt ett chocktillstånd och död. Vid mindre injektionsmängder uppvisar kroppen en ökad kapillärpermeabilitet och en lång rad andra cirkulationsförändringar. Exempel på dessa förändringar visas genom en minskning följt av en ökning av antalet vita blodkroppar, tumörblödningar och förändringar i venösa tryck.

I speciella fall kan pyrogener visa Shwartzmans fenomen. Detta är en allvarlig hemorragisk reaktion med lokaliserad nekros. Det kan demonstreras på en kanin som först injiceras subkutant med ett bakteriellt pyrogen, och kaninen injiceras sedan intravenöst 24 timmar senare med samma pyrogen. Platsen för den senare injektionen blir blå i mitten och röd i periferin.

Pyrogentolerans är en annan viktig reaktion som utvecklas när djuren får upprepade injektioner av ett pyrogen. En minskad känslighet för samma och andra pyrogener utvecklas, vilket upphäver den febrila reaktionen och kräver att det toleranta djuret tas bort från ytterligare pyrogensprövning. Med ”känslighet” avses att djuret reagerar på en minimal mängd pyrogena ämnen. Även om kaninen är det mest använda försöksdjuret anses människan vara mest känslig för pyrogener.

Bakteriella toxiner

Det finns två allmänna typer av bakteriella toxiner. \5\ Exotoxiner produceras under tillväxtfasen hos vissa typer av bakterier och frigörs i mediet eller vävnaden. Exotoxiner är av proteinkaraktär och deras reaktioner är specifika. Clostridium botulinum producerar till exempel ett exotoxin av ovanlig styrka som endast påverkar neurologisk vävnad. Andra välkända exempel på exotoxiner är tetanustoxin, Shigatoxin och difteritoxin.

Endotoxiner är en annan typ av toxin som kan utvinnas från en mängd olika gramnegativa bakterier. Termen ”endotoxin” är vanligtvis utbytbar med termen ”pyrogen”, även om inte alla pyrogener är endotoxiner och pyrogtestning kan inte enbart användas helt och hållet för detektion och karakterisering av mikrobiella endotoxiner. Det krävs högre doser av endotoxin för att åstadkomma en dödlig effekt hos försöksdjuret än vad som krävs för exotoxiner. De effekter som endotoxiner ger upphov till hos värden är systemiska, t.ex. feber och allmänna kroppsreaktioner, snarare än rent neurologiska effekter, vilket är fallet med de flesta exotoxiner. Endotoxiner förekommer främst i gramnegativa bakterier och bildas efter celldöd och autolys av cellerna. Endotoxinerna utvinns ur och associeras med cellstrukturen (cellväggen). Goda exempel på pyrogenproducerande bakterier är S. typhosa, E. coli och Ps. aeruginosa.

Tillkommande egenskaper hos pyrogener

I en förteckning över ytterligare egenskaper kan man säga att pyrogener: (1) är kända för att biokemiskt bestå av en lipid-polysackarid-peptid-substans, (2) är värmestabila vid kokande vattentemperatur, (3) har en relativt låg akut toxicitet för människan, (4) uppvisar en låg grad av immunsvar och (5) kan produceras av persistenta gramnegativa bakterier som kan ha en 50-procentig dödlighet. \6\

Läkare uppmanas att omedelbart söka efter orsaken till ihållande bakterieemier. Möjliga källor kan vara felbitis vid kateterplatsen, infusionsutrustning eller den parenterala lösningen. Det är intressant att notera att hanteringen av patienter i pyrogen chock innefattar administrering av parenterala vätskor (som förhoppningsvis inte är pyrogena).

Måttet att göra det pyrogenfritt

Bakteriedödande förfaranden som uppvärmning, filtrering eller adsorptionstekniker eliminerar inte pyrogena ämnen från parenterala lösningar. Alla ingredienser måste först och främst hållas pyrogenfria. För att säkerställa detta utför tillverkaren omfattande pyrogen-screeningstester på alla ingredienser i parenterala läkemedel och ser till att de förvaras på rätt sätt före användning. I idealfallet känner tillverkaren till de kritiska stegen i tillverkningen som kan möjliggöra tillväxt av pyrogenproducerande bakterier, och han övervakar dessa områden rutinmässigt. Till exempel skulle vattnet i behållarna testas med avseende på pyrogener, och tillverkaren skulle insistera på minimala uppehållstider så att endast pyrogenfritt vatten används. Pyrogenfritt vatten, som ”vatten för injektion” enligt USP, är kärnan i parenteralindustrin.

Pyrogenanalys – USP

Den nuvarande USP beskriver tydligt pyrogenanalysen. USP XIX anser att en lösning är pyrogen när 10 m1/kg injiceras i en kanin och det sker en temperaturhöjning på 0,6 C eller mer för någon kanin, eller en total temperaturhöjning på mer än 1,4 C för tre kaniner i en testgrupp med tre kaniner. Den officiella kaninmetoden kräver mycket tid, kostnader, utbildning och erfarenhet för att behärska den. Det finns få genvägar. Konsekvensen av att inte testa för pyrogener kan bli ännu dyrare i form av patientreaktioner och återkallande av läkemedel.

Pyrogenanalys – Limulus amöbocytlysat

Många laboratorier utför pyrogenanalyser med hjälp av testmetoden Limulus amöbocytlysat (LAL). \LAL-metoden är särskilt användbar för screening av produkter som det är opraktiskt att testa med kaninmetoden. De produkter som bäst testas för endotoxiner med LAL-teknik är radiofarmaka, anestetika och många biologiska produkter. I huvudsak innebär LAL-metoden att hemolymphe (blod) från en hästskogskrabba (limulus polyphemus) reagerar med ett endotoxin för att bilda en gel. Mängden endotoxin som gelerar bestäms med hjälp av utspädningsmetoder där gelbildningen av ett testprov jämförs med gelbildningen av ett referenspyrogen, eller med hjälp av spektrofotometriska metoder där opaciteten hos gelbildningen av ett testprov jämförs med opaciteten hos ett referenspyrogen. LAL-testet anses vara specifikt för förekomst av endotoxiner och är minst hundra gånger känsligare än kanintestet. \8\, \9\ Till och med picogrammkvantiteter av endotoxiner kan påvisas med LAL-metoden. Även om LAL är en relativt ny pyrogen testmetod har det visats en mängd olika polysackaridderivat som ger positiva limulus-testresultat och även visar feberaktivitet. Det är också ett faktum att vissa ämnen stör LAL-testet även om pyrogener förekommer.

Vissa företag använder LAL-testet för att screena pyrogener i råvaror och följer upp med pyrogtestning av slutprodukten med hjälp av USP:s kanintest. LAL-testet för pyrogener i läkemedel kräver en ändring av NDA för varje enskild produkt. LAL-testreagenserna är licensierade av Bureau of Biologics. När det gäller produkter måste ett företag få sitt protokoll godkänt av direktören för Bureau of Medical Devices innan det kan ersätta kaninen med LAL-testet. \LAL-testets framtid verkar lovande i och med att man överväger att inkludera det i USP, men det är inte en officiell metod för närvarande.

Det som är säkert är att pyrogener förblir en potentiell källa till fara vid användning av parenteral terapi. En total uteslutning av pyrogener kräver vår fortsatta övervakning av tillverkningen av parenterala läkemedel. \a)\Parenteral (para = bortom; enteron = tarm) Inte genom matsmältningskanalen utan genom någon annan väg, t.ex. subkutant, intramuskulärt, intravenöst, intraspinal etc.

\b)\Pyrogen – ett feberframkallande agens av bakteriellt ursprung; endotoxin. Dorland’s Illustrated Medical Dictionary. 25th E.W.B. Saunders, Philadelphia.

1. Singer, Charles Joseph; Underwood, Edgar Ashworth. A Short History of Medicine. 2nd Ed., 1962. Oxford Univ. Press, NY och Oxford.
2. Hindman, S. H. et al. ”Pyrogenic Reactions During Haemodialyzing Caused by Endotoxin”. Lancet 2 (7938): 732-4, 18 oktober 1975.
3. Kadis, Solomon; Weinbaum, George; Ajl, Samuel J.; Microbial Toxins Vol. IV & V. 1971 Academic Press, NY & London.
4. Davis, Bernard E, et al. Endotoxiner: Textbook of Microbiology, s 615-7. Fjärde tryckning. Hoeber Medical Division. Harper & Row Publishers, NY.
5. Stainer, Roger Y.; Doudoroff, Michael; Adelberg, Edward A. The Microbial World, Prentice Hall, Inc., 3rd Ed., 1970.
6. Krupp, Marcus A. & Chatton, Milton J.; Current Medical Diagnosis and Treatment. s. 775, Lange Medical Publications, 1975, Los Altos, CA
7. Rastogi, S. C.; Hochstein, H. D.; Seligman, E. B. Jr.; ”Statistical Determination of Endotoxin Content in Influenza Virus Vaccine by the Limulus Amoebocyte Lysate Test”. J. Clin Microbiol 6(2): 144-8, augusti 1977.
8. Nandan, R.; Nakashima, C. Y., Brown, D. R.; ”Detection of Endotoxins in Human Blood and Plasma”. Ett förbättrat in-vitro-pyrogentest. Clin Chem 23(11): 2080-4 Nov. 1977.
9. Wachtel, R. E.; Tskji, K.; ”Comparison of Limulus Amoebocyte Lysates and Correlation with the USP Pyrogen Test”. Appl. Environ. Microbiology 33(6) 1265-9, juni 1977.
10. Docket No. 77N-0282 enligt FR Doc. 77-31926 File 11-3-77 (Vol. 42, No. 213 — Friday, November 4, 1977) och som finns i FR Doc. 78-623 Arkiverad 1-12-78 (Vol. 43, No. 9 — fredag den 3 januari 1978)