生体内では、キモトリプシンは多くの生物の消化器官で働くタンパク質分解酵素（セリンプロテアーゼ）である。 加水分解反応によりペプチド結合を切断する。この反応は熱力学的に有利であるにもかかわらず、触媒がない場合には極めてゆっくりと起こる。 キモトリプシンの主な基質は、結合のN末端側のアミノ酸がトリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシンのいずれかであるペプチド結合であり、このようなペプチド結合を切断するためには、キモトリプシンの基質となるアミノ酸が必要である。 多くのプロテアーゼと同様に、キモトリプシンも試験管内でアミド結合を加水分解する。この長所は、N-アセチル-L-フェニルアラニンp-ニトロフェニルアミドなどの基質アナログを酵素分析に使用できるようにしたことである。
Chymotrypsin は、反応しないカルボニル基を強力な求核剤で攻撃してペプチド結合を切断する。 は、酵素の活性部位に位置するセリン195残基と短時間共有結合し、酵素-基質中間体を形成する。
この発見は、酵素-基質中間体であるp-ニトロフェノレートが黄色い色をしており、410nmの吸光度でその濃度を測定できることを利用した阻害試験と前述の基質の切断の動力学の研究によってなされました。
キモトリプシンとその基質の反応は、反応開始時の「バースト」段階とミカエリス・メンテンキネティクスに従う定常段階の2段階で行われることがわかった。 キモトリプシンの作用機序は、加水分解が2段階で行われることでこれを説明する。 まず、基質をアシル化してアシル酵素中間体を形成し、次に脱アシル化して酵素をもとの状態にもどす。 これは、触媒三重鎖の3つのアミノ酸残基の協奏的な作用によって行われる。 アスパラギン酸はヒスチジンのN-δ水素に水素結合し、そのε窒素のpKaを増加させ、セリンを脱プロトン化することができるようにする。 この脱プロトン化により、セリン側鎖は求核剤として働き、タンパク質主鎖の電子不足のカルボニル炭素に結合することができるようになる。 カルボニル酸素のイオン化は、隣接する主鎖のN-水素と2つの水素結合を形成することによって安定化される。 これはオキシアニオンホールで起こる。 これは四面体付加物を形成し、ペプチド結合が切断される。 セリンと結合したアシル酵素中間体が形成され、切断されたタンパク質の新しく形成されたアミノ末端が解離することができる。 第二反応段階では、水分子が塩基性ヒスチジンによって活性化され、求核剤として作用する。 水の酸素がセリン結合アシル基のカルボニル炭素を攻撃し、第2の四面体付加体が形成され、セリン-OH基が再生され、プロトンが放出され、新たにカルボキシル末端を持つタンパク質断片が形成される
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