In vivo, chimotripsina este o enzimă proteolitică (serin protează) care acționează în sistemele digestive ale multor organisme. Ea facilitează scindarea legăturilor peptidice printr-o reacție de hidroliză, care, în ciuda faptului că este favorabilă din punct de vedere termodinamic, se produce extrem de lent în absența unui catalizator. Principalele substraturi ale chimotripsinei sunt legăturile peptidice în care aminoacidul N-terminal al legăturii este un triptofan, tirozină, fenilalanină sau leucină. La fel ca multe proteaze, chimotripsina hidrolizează, de asemenea, legăturile amidice in vitro, virtute care a permis utilizarea unor analogi de substrat, cum ar fi N-acetil-L-fenilalanina p-nitrofenil amidă pentru testele enzimatice.
Chimotripsina scindează legăturile peptidice prin atacarea grupului carbonil nereactiv cu un nucleofil puternic, reziduul serină 195 situat în situsul activ al enzimei, care se leagă pentru scurt timp în mod covalent de substrat, formând un intermediar enzimă-substrat. Împreună cu histidina 57 și acidul aspartic 102, acest reziduu de serină constituie triada catalitică a situsului activ.
Aceste constatări se bazează pe teste de inhibiție și pe studiul cineticii de scindare a substratului menționat mai sus, exploatând faptul că intermediarul enzimă-substrat p-nitrofenolat are o culoare galbenă, ceea ce permite măsurarea concentrației sale prin măsurarea absorbției luminii la 410 nm.
S-a constatat că reacția chimotripsinei cu substratul său are loc în două etape, o fază inițială „burst” la începutul reacției și o fază de echilibru care urmează cinetica Michaelis-Menten. Modul de acțiune al chimotripsinei explică acest lucru prin faptul că hidroliza are loc în două etape. Mai întâi, acilarea substratului pentru a forma un intermediar acil-enzimă, iar apoi dezacilarea pentru a readuce enzima la starea inițială. Acest lucru are loc prin acțiunea concertată a reziduurilor de trei aminoacizi din triada catalitică. Aspartatul se leagă la hidrogen de hidrogenul N-δ al histidinei, mărind pKa azotului ε al acesteia, făcându-l astfel capabil să deprotoneze serina. Această deprotonare permite lanțului lateral al serinei să acționeze ca un nucleofil și să se lege de carbonul carbonil cu deficit de electroni al lanțului principal al proteinei. Ionizarea oxigenului carbonil este stabilizată prin formarea a două legături de hidrogen cu N-hidrogenii adiacenți din lanțul principal. Acest lucru are loc în gaura oxi-anionului. Se formează astfel un aduct tetraedric și ruperea legăturii peptidice. Se formează un intermediar acil-enzimatic, legat de serină, iar terminația amino nou formată a proteinei scindate se poate disocia. În cea de-a doua etapă a reacției, o moleculă de apă este activată de histidina bazică și acționează ca nucleofil. Oxigenul apei atacă carbonul carbonil al grupului acil legat de serină, rezultând formarea unui al doilea aduct tetraedric, regenerarea grupului -OH al serinei și eliberarea unui proton, precum și a fragmentului de proteină cu terminația carboxilică nou formată
.