In vivo är chymotrypsin ett proteolytiskt enzym (serinproteas) som verkar i många organismers matsmältningssystem. Det underlättar klyvningen av peptidbindningar genom en hydrolysreaktion, som trots att den är termodynamiskt gynnsam sker extremt långsamt i avsaknad av en katalysator. Chymotrypsinets huvudsakliga substrat är peptidbindningar där den aminosyra som är N-terminal till bindningen är tryptofan, tyrosin, fenylalanin eller leucin. I likhet med många proteaser hydrolyserar chymotrypsin även amidbindningar in vitro, vilket gjorde det möjligt att använda substratanaloger som N-acetyl-L-fenylalanin p-nitrofenylamid för enzymanalyser.
Chymotrypsin klyver peptidbindningar genom att angripa den oreaktiva karbonylgruppen med en kraftig nukleofil, serin 195-resultatet i enzymets aktiva plats, som kortvarigt blir kovalent bunden till substratet och bildar en enzym-substrat-intermediär. Tillsammans med histidin 57 och asparaginsyra 102 utgör denna serinrest den katalytiska triaden i den aktiva platsen.
Dessa resultat bygger på inhiberingsanalyser och studiet av kinetiken för klyvning av det ovannämnda substratet, genom att utnyttja det faktum att enzym-substratintermediären p-nitrofenolat har en gul färg, vilket gör det möjligt att mäta koncentrationen av det genom att mäta ljusabsorptionen vid 410 nm.
Chymotrypsinets reaktion med sitt substrat befanns äga rum i två steg, en inledande ”burst”-fas i början av reaktionen och en stationär fas som följer Michaelis-Menten-kinetiken. Chymotrypsins verkningsmekanism förklarar detta med att hydrolysen sker i två steg. Först acylering av substratet för att bilda en acylenzymintermediär och sedan deacylering för att återföra enzymet till sitt ursprungliga tillstånd. Detta sker genom samverkan mellan de tre aminosyraresterna i den katalytiska triaden. Aspartat vätebinds till histidinets N-δ-väte och ökar pKa för dess ε-kväve, vilket gör att det kan deprotonera serin. Denna deprotonering gör det möjligt för serinets sidokedja att fungera som nukleofil och binda till det elektronfattiga karbonylkolet i proteinets huvudkedja. Joniseringen av karbonylsyre stabiliseras genom bildandet av två vätebindningar till intilliggande N-hydrogener i huvudkedjan. Detta sker i oxyanjonhålet. Detta bildar en tetraedrisk addukt och bryter peptidbindningen. En acylenzymintermediär, bunden till serinet, bildas och den nybildade aminoterminus av det klyvda proteinet kan dissociera. I det andra reaktionssteget aktiveras en vattenmolekyl av det basiska histidinet och fungerar som nukleofil. Vattnets syre angriper karbonylkolet i den serinbundna acylgruppen, vilket resulterar i bildandet av en andra tetraedrisk addukt, regenerering av serinets -OH-grupp och frisättning av en proton, samt proteinfragmentet med den nybildade karboxylterminen