In vivo, la chimotripsina è un enzima proteolitico (serina proteasi) che agisce nel sistema digestivo di molti organismi. Facilita la scissione dei legami peptidici con una reazione di idrolisi che, nonostante sia termodinamicamente favorevole, avviene molto lentamente in assenza di un catalizzatore. I principali substrati della chimotripsina sono i legami peptidici in cui l’amminoacido N-terminale al legame è un triptofano, tirosina, fenilalanina o leucina. Come molte proteasi, la chimotripsina idrolizza anche i legami amidici in vitro, una virtù che ha permesso l’uso di analoghi del substrato come la N-acetil-L-fenilalanina p-nitrofenilammide per i saggi enzimatici.
La chimotripsina scinde i legami peptidici attaccando il gruppo carbonile non attivo con un potente nucleofilo, il residuo di serina 195 situato nel sito attivo dell’enzima, che si lega brevemente in modo covalente al substrato, formando un intermedio enzima-substrato. Insieme all’istidina 57 e all’acido aspartico 102, questo residuo di serina costituisce la triade catalitica del sito attivo.
Questi risultati si basano su saggi di inibizione e sullo studio della cinetica di scissione del suddetto substrato, sfruttando il fatto che l’intermedio enzima-substrato p-nitrofenolato ha un colore giallo, che permette di misurare la sua concentrazione misurando l’assorbanza luminosa a 410 nm.
La reazione della chimotripsina con il suo substrato si è rivelata avvenire in due fasi, una fase iniziale “burst” all’inizio della reazione e una fase stazionaria secondo la cinetica di Michaelis-Menten. La modalità d’azione della chimotripsina spiega che l’idrolisi avviene in due fasi. Prima, l’acilazione del substrato per formare un intermedio acil-enzimatico, e poi la deacilazione per riportare l’enzima al suo stato originale. Questo avviene tramite l’azione concertata dei tre residui di amminoacidi nella triade catalitica. L’aspartato si lega a idrogeno all’idrogeno N-δ dell’istidina, aumentando il pKa del suo azoto ε, rendendolo così capace di deprotonare la serina. Questa deprotonazione permette alla catena laterale della serina di agire come un nucleofilo e di legarsi al carbonio carbonilico carente di elettroni della catena principale della proteina. La ionizzazione dell’ossigeno carbonilico è stabilizzata dalla formazione di due legami idrogeno con gli N-idrogeni adiacenti della catena principale. Questo avviene nel foro dell’ossianione. Ciò forma un addotto tetraedrico e la rottura del legame peptidico. Si forma un intermedio acil-enzimatico, legato alla serina, e il nuovo terminale amminico della proteina scissa può dissociarsi. Nella seconda fase di reazione, una molecola d’acqua viene attivata dall’istidina basica e agisce come nucleofilo. L’ossigeno dell’acqua attacca il carbonio carbonilico del gruppo acilico legato alla serina, con conseguente formazione di un secondo addotto tetraedrico, rigenerazione del gruppo -OH della serina e rilascio di un protone, così come il frammento proteico con il nuovo terminale carbossilico formato