クロマトグラフィーは、前述のように、固定相と移動相の2相を含む分離プロセスである。 一般的に、固定相はガラスや金属のチューブに詰められたり、オープンチューブのキャピラリーの壁を構成する多孔質固体（例えば、ガラス、シリカ、アルミナ）である。 移動相は充填床またはカラムの中を流れる。 分離すべき試料はカラムの始点で注入され、移動相によってシステム内を移動する。 カラムを通過する間に、異なる物質が2つの相に対する相対的な親和性に応じて分配される。 移動速度は分配係数の値に依存し、固定相との相互作用が強い成分ほど溶出（カラムから完全に除去）するのに長い時間を必要とする。 したがって、分離は、カラムを通過する移動時間の違いに反映される分布挙動の違いに基づいて行われます。 繰り返し抽出の場合と同様に、2つの成分の分離係数が大きければ大きいほど、2つの成分を分離するのに必要なカラムは短くなります。 このように、クロマトグラフィーは多段抽出と似ていますが、クロマトグラフィーでは不連続なステップがなく、連続的な流れがあることが特徴です。
クロマトグラフィーは、気体：ガスクロマトグラフィー（GC）、液体：液体クロマトグラフィー（LC）、超臨界流体：超臨界流体クロマトグラフィー（SFC）など、移動相の違いで特徴づけられています。 さらに、固定相の観点から細分化され、固定相が固体吸着剤であれば、気体-固体クロマトグラフィー（GSC）、液体-固体クロマトグラフィー（LSC）などの方法がある。 クロマトグラフィーは、コンピュータ制御の装置で高精度かつ無人運転で行われる。 また、カラムの後に検出器がオンラインで設置されることが多く、構造解析や定量、あるいはその両方を行うことができます。
ガスクロマトグラフィーは、そのスピード、分解力、検出器の感度から、重要な分析方法の1つです。
ガスクロマトグラフィーは、スピード、分解能、検出感度などにおいて重要な手法であり、気化に依存するため、分解せずに気化できる化合物に最も適している。
クロマトグラフィーのほか、モレキュラーシーブと呼ばれる特殊な吸着剤を用いた気固分配による精製も広く行われている。 この材料は、低分子とほぼ同じ寸法の孔を持つ。 この性質を利用して、線状構造の分子と嵩高構造の分子を分離することができる。 前者は容易に孔に入り込むことができるが、後者は入り込むことができない。 これは、形状の違いによる排除型分離の一例である。 気体の乾燥にもモレキュラーシーブが重要な役割を果たす。極性物質である水（分子内に正負の電荷が偏在している）は吸着しやすいが、極性の低い気体は保持されない。
昇華法では、すべての物質が昇華するわけではないので、適用範囲が限られる。
1970年代初頭から、液体クロマトグラフィーが有機物質の主要な分離法として発展してきた。 移動相が液体であるため、気化の必要がなく、GCに比べてはるかに広範囲の物質を分離することができる。 これまでに、無機イオン、アミノ酸、薬物、糖類、オリゴヌクレオチド、タンパク質などの分離に成功している。 マイクログラムからミリグラムレベルの分析用液体クロマトグラフィーと、数十グラムレベルの分取用液体クロマトグラフィーの両方が開発された。
重要な方法の1つに、液体-固体クロマトグラフィーがあります。多孔質の吸着剤が極性を持ち、化合物のクラスの特性に基づいて分離します。例えば、アミン（アルカリ性）とアルコール（中性）、エステル（中性）と酸などです。
液体-固体クロマトグラフィーは、クロマトグラフィーの中で最も古い方法です。20世紀半ばまで、実験手順は元の形からあまり変わっていませんでした。 大幅な改良を経て、現在では直径3～5マイクロメートル（0.00012～0.00020インチ）の多孔質粒子を用い、液体ポンプで粒子を充填したカラムに液体を流し込んで行う液体-固体クロマトグラフィーを行っている。 粒子が小さいため、高速の移動相速度（1cm/sec以上）でも効率が良く、高分離能と高速分離を実現することができる。
液体-固体クロマトグラフィーの重要な手順として逆相クロマトグラフィーがあり、液体移動相は水とメタノールやアセトニトリルなどの有機溶媒を組み合わせ、固定相表面は非極性または炭化水素系である。 吸着剤表面が極性である順相クロマトグラフィーに対し、逆相クロマトグラフィーはカラムから極性の高い順に物質が溶出されるのが特徴です。 また、物質の非極性に着目した分離が行われる。 遺伝子組み換え医薬品であるヒト成長ホルモンから一連のペプチドを分離する際には、酵素であるトリプシンを用いて塩基性アミノ酸であるアルガニンとリジンを含むペプチド結合を切断し、タンパク質の特異的なフィンガープリントを得ることができる。
イオン交換クロマトグラフィー（IEC）は液体-固体クロマトグラフィーの一種であるが、その重要性は特筆に値する。 分離の基本は、溶液中のさまざまなイオンが、細かく分割された不溶性の物質（イオン交換体、通常は合成樹脂）上の反対側に帯電した部位にさまざまに引き寄せられることです。 陽イオン交換樹脂では、すべての部位が負に帯電しているため、正のイオンのみが分離され、陰イオン交換樹脂では、正に帯電した部位が分離される。
イオン交換の重要な応用例として、硬水から溶解した鉄、カルシウム、マグネシウムを除去することが挙げられます。
液体-固体吸着クロマトグラフィーは、薄い平らな板（薄層クロマトグラフィー、またはTLC）上で行うことができます。 TLCは安価で迅速ですが、カラムクロマトグラフィーのような感度や効率はありません。 実際には、吸着剤をガラス板上に広げ、乾燥させます。 サンプルはプレートの一端近くにスポットとして塗布され、移動相を含む浅いリザーバに（垂直に）置かれます。 移動相が毛細管現象によってプレートを上昇するにつれて、試料は液体に溶解し、その成分は出発点からの距離を変えながら新しい位置に運ばれていく。 (詳細はクロマトグラフィーの項を参照）。