Cromatografia, como já foi dito, é um processo de separação que envolve duas fases, uma estacionária e a outra móvel. Normalmente, a fase estacionária é um sólido poroso (por exemplo, vidro, sílica ou alumina) que é embalado em um tubo de vidro ou metal ou que constitui as paredes de um capilar de tubo aberto. A fase móvel flui através do leito ou coluna embalada. A amostra a ser separada é injetada no início da coluna e é transportada através do sistema pela fase móvel. No seu percurso através da coluna, as diferentes substâncias se distribuem de acordo com sua afinidade relativa para as duas fases. A taxa de deslocamento depende dos valores dos coeficientes de distribuição, os componentes interagem mais fortemente com a fase estacionária exigindo períodos de tempo mais longos para a eluição (remoção completa da coluna). Assim, a separação é baseada em diferenças no comportamento da distribuição refletidas em diferentes tempos de migração através da coluna. Como na extração repetitiva, quanto maior for o fator de separação para um par de componentes, mais curta será a coluna necessária para resolvê-los. A cromatografia é, portanto, análoga à extração em várias etapas, exceto que na cromatografia não há etapas descontínuas, mas sim um fluxo contínuo. Atualmente, a cromatografia é o método mais significativo para a separação de substâncias orgânicas e, juntamente com a eletroforese, é mais utilizado para substâncias biológicas.
Os vários métodos cromatográficos são caracterizados em termos de fase móvel – gás: cromatografia gasosa (GC); líquido: cromatografia líquida (LC); fluido supercrítico: cromatografia supercrítico-fluido (SFC). Os métodos são então subdivididos em termos da fase estacionária; assim, se a fase estacionária é um adsorvente sólido, existem métodos como a cromatografia gás-sólido (GSC) e a cromatografia líquido-sólido (LSC). A cromatografia é conduzida com instrumentação controlada por computador para alta precisão e operação sem supervisão. Além disso, um detector é frequentemente colocado on-line após a coluna para análise ou quantificação da estrutura ou ambos. Uma das abordagens mais poderosas de análise agora disponíveis é o acoplamento on-line da cromatografia à espectrometria de massa.
Cromatografia a gás é um método importante devido à sua velocidade, potência de resolução e sensibilidade do detector. Uma vez que depende da vaporização, esta técnica é mais adequada para compostos que podem ser vaporizados sem sofrer decomposição. Muitas substâncias que normalmente não se evaporam facilmente podem ser derivadas quimicamente para a separação bem sucedida da volatilização por cromatografia gasosa.
Além da cromatografia, a distribuição sólido-gás também é amplamente empregada para purificação, usando adsorventes especiais chamados peneiras moleculares. Estes materiais contêm poros de aproximadamente as mesmas dimensões que as pequenas moléculas. Esta propriedade pode ser explorada na separação de moléculas com estruturas lineares daquelas com estruturas volumosas. Os primeiros podem entrar facilmente nos poros, mas os segundos são incapazes de penetrar. Este é um exemplo de um mecanismo de exclusão de separação (baseado em diferenças de forma). As peneiras moleculares também desempenham um papel importante na secagem dos gases: a água, uma substância polar (ou seja, suas cargas elétricas líquidas positivas e negativas são distribuídas desigualmente dentro da molécula), é prontamente adsorvida nas partículas, mas os gases que são menos polares não são retidos.
Em sublimação, outro método de distribuição gás-sólido, um sólido evapora sem passar pelo estado líquido. Como nem todas as substâncias sublimes, a aplicabilidade do método é limitada.
Desde o início dos anos 70, a cromatografia líquida desenvolveu-se como o principal método de separação de substâncias orgânicas. Como a fase móvel é um líquido, a exigência de vaporização é eliminada, e portanto a LC pode separar uma gama muito mais ampla de substâncias do que a GC. As espécies que têm sido resolvidas com sucesso incluem íons inorgânicos, aminoácidos, drogas, açúcares, oligonucleotídeos e proteínas. Tanto a cromatografia líquida em escala analítica com amostras a nível de micrograma a miligrama como a cromatografia líquida em escala preparatória a nível de dez gramas foram desenvolvidas. Em biotecnologia, a cromatografia líquida em escala preparativa é especialmente importante para a purificação de proteínas e hormônios peptídeos feita por tecnologia recombinante.
Um método importante é a cromatografia líquido-sólido, na qual o adsorvente poroso é polar e a separação é baseada nas propriedades de classes de compostos – por exemplo, aminas (alcalinas) de álcoois (neutros) e ésteres (neutros) de ácidos.
Cromatografia líquido-sólido é o mais antigo dos métodos cromatográficos. Até meados do século XX, o procedimento experimental não tinha mudado muito em relação à sua forma original. Após melhorias significativas, agora a cromatografia sólido-líquido é realizada com partículas porosas de até 3-5 micrômetros (0,00012-0,00020 polegadas) de diâmetro, e bombas líquidas são usadas para conduzir o líquido através da coluna cheia de partículas. Alta resolução e separações rápidas são conseguidas, uma vez que as pequenas partículas permitem uma boa eficiência com velocidades de fase móveis rápidas (um centímetro por segundo ou mais). Esta técnica também é importante na purificação, e as substâncias separadas podem ser coletadas automaticamente após a coluna usando um coletor de fração.
Um procedimento significativo de cromatografia líquida sólida é a cromatografia de fase reversa, na qual a fase móvel líquida é água combinada com um solvente orgânico como metanol ou acetonitrilo e a superfície da fase estacionária é não-polar ou tipo hidrocarboneto. Em contraste com a cromatografia de fase normal, onde a superfície adsorvente é polar, na cromatografia de fase reversa a eluição de substâncias da coluna está na ordem de polaridade crescente. Além disso, a separação é baseada nos aspectos não polares das substâncias. Na separação de uma série de peptídeos do hormônio de crescimento humano, uma droga recombinante, uma enzima, a tripsina, é usada para quebrar ligações peptídeas contendo os aminoácidos básicos -arganina e lisina – para produzir uma impressão digital específica da proteína. O mapeamento do peptídeo é um método crítico para avaliar a pureza de substâncias complexas como proteínas.
Cromatografia de troca de íons (IEC) é uma subdivisão da cromatografia sólido-líquido, mas sua importância é tal que merece menção especial. Como o nome indica, o processo separa íons; a base da separação é a atração variável de diferentes íons em uma solução para locais com cargas opostas em uma substância finamente dividida e insolúvel (o trocador de íons, geralmente uma resina sintética). Numa resina permutadora de catiões, todos os locais são carregados negativamente, para que apenas os iões positivos possam ser separados; uma resina permutadora de aniões tem locais com carga positiva. A cromatografia de troca iónica tornou-se um dos métodos mais importantes para separar proteínas e pequenos oligonucleótidos.
Uma aplicação importante da troca iónica é a remoção de iões de ferro dissolvidos, cálcio e magnésio de água dura. Os locais negativos em um trocador catiônico são primeiramente neutralizados com íons sódio pela exposição a uma solução forte de sal comum (cloreto de sódio); quando a água dura passa através da resina, os íons indesejáveis na água são substituídos por íons sódio.
Cromatografia de adsorção sólido-líquido também pode ser realizada em placas finas e planas (cromatografia em camada fina, ou TLC). A TLC é barata e rápida, mas não tão sensível ou eficiente como a cromatografia em coluna. Na prática, o adsorvente é espalhado em uma placa de vidro e seco. A amostra é aplicada como um ponto próximo a uma extremidade da placa, que é colocada (verticalmente) em um reservatório raso contendo a fase móvel. À medida que a fase móvel percorre a placa por acção capilar, a amostra dissolve-se no líquido e os seus componentes são transportados para cima da placa para novas posições a distâncias variáveis do ponto de partida. (Para mais discussão, ver o artigo cromatografia.)