La cromatografía, como se ha señalado anteriormente, es un proceso de separación que implica dos fases, una estacionaria y otra móvil. Típicamente, la fase estacionaria es un sólido poroso (por ejemplo, vidrio, sílice o alúmina) que se empaca en un tubo de vidrio o metal o que constituye las paredes de un capilar de tubo abierto. La fase móvil fluye a través del lecho empacado o de la columna. La muestra a separar se inyecta al principio de la columna y es transportada a través del sistema por la fase móvil. En su recorrido por la columna, las diferentes sustancias se distribuyen según su afinidad relativa por las dos fases. La velocidad de desplazamiento depende de los valores de los coeficientes de distribución, ya que los componentes que interactúan más fuertemente con la fase estacionaria requieren períodos de tiempo más largos para la elución (eliminación completa de la columna). Así, la separación se basa en las diferencias de comportamiento de distribución que se reflejan en los diferentes tiempos de migración a través de la columna. Al igual que en la extracción repetitiva, cuanto mayor sea el factor de separación para un par de componentes, más corta será la columna necesaria para resolverlos. La cromatografía es, pues, análoga a la extracción multietapa, con la diferencia de que en la cromatografía no hay pasos discontinuos, sino un flujo continuo. En la actualidad, la cromatografía es el método más importante para la separación de sustancias orgánicas y, junto con la electroforesis, es el más utilizado para las sustancias biológicas.
Los distintos métodos cromatográficos se caracterizan en función de la fase móvil: gas: cromatografía de gases (GC); líquido: cromatografía de líquidos (LC); fluido supercrítico: cromatografía de fluidos supercríticos (SFC). Los métodos se subdividen a su vez en función de la fase estacionaria; así, si la fase estacionaria es un adsorbente sólido, existen métodos como la cromatografía gas-sólido (GSC) y la cromatografía líquido-sólido (LSC). La cromatografía se lleva a cabo con instrumentación controlada por ordenador para lograr una alta precisión y un funcionamiento desatendido. Además, con frecuencia se coloca un detector en línea después de la columna para el análisis de la estructura, la cuantificación o ambos. Uno de los enfoques de análisis más potentes que existen en la actualidad es el acoplamiento en línea de la cromatografía a la espectrometría de masas.
La cromatografía de gases es un método importante debido a su velocidad, poder de resolución y sensibilidad del detector. Dado que depende de la vaporización, esta técnica se adapta mejor a los compuestos que pueden ser vaporizados sin sufrir descomposición. Muchas sustancias que normalmente no se vaporizan con facilidad pueden derivarse químicamente para que la separación por volatilización tenga éxito mediante la cromatografía de gases.
Además de la cromatografía, la distribución gas-sólido también se emplea ampliamente para la purificación, utilizando adsorbentes especiales llamados tamices moleculares. Estos materiales contienen poros de aproximadamente las mismas dimensiones que las moléculas pequeñas. Esta propiedad puede aprovecharse para separar las moléculas con estructuras lineales de las que tienen estructuras voluminosas. Las primeras pueden entrar fácilmente en los poros, pero las segundas no pueden penetrar. Este es un ejemplo de mecanismo de exclusión de la separación (basado en las diferencias de forma). Los tamices moleculares también desempeñan un papel importante en el secado de los gases: el agua, una sustancia polar (es decir, sus cargas eléctricas netas positivas y negativas están distribuidas de forma desigual dentro de la molécula), se adsorbe fácilmente en las partículas, pero los gases que son menos polares no son retenidos.
En la sublimación, otro método de distribución gas-sólido, un sólido se evapora sin pasar por el estado líquido. Como no todas las sustancias se subliman, la aplicabilidad del método es limitada.
Desde principios de la década de 1970, la cromatografía líquida se ha desarrollado como el principal método de separación de sustancias orgánicas. Dado que la fase móvil es un líquido, se elimina el requisito de la vaporización y, por tanto, la CL puede separar una gama mucho más amplia de sustancias que la CG. Las especies que se han resuelto con éxito incluyen iones inorgánicos, aminoácidos, fármacos, azúcares, oligonucleótidos y proteínas. Se ha desarrollado tanto la cromatografía líquida a escala analítica con muestras del nivel de microgramos a miligramos como la cromatografía líquida a escala preparatoria del nivel de decenas de gramos. En biotecnología, la cromatografía líquida a escala preparatoria es especialmente importante para la purificación de proteínas y hormonas peptídicas fabricadas mediante tecnología recombinante.
Un método importante es la cromatografía líquido-sólido en la que el adsorbente poroso es polar y la separación se basa en las propiedades de las clases de compuestos -por ejemplo, aminas (alcalinas) de alcoholes (neutros) y ésteres (neutros) de ácidos.
La cromatografía líquido-sólido es el más antiguo de los métodos cromatográficos. Hasta mediados del siglo XX, el procedimiento experimental no había cambiado mucho respecto a su forma original. Tras importantes mejoras, la cromatografía líquido-sólido se realiza ahora con partículas porosas de tan sólo 3-5 micrómetros (0,00012-0,00020 pulgadas) de diámetro, y se utilizan bombas de líquido para impulsar el líquido a través de la columna llena de partículas. Se consigue una alta resolución y separaciones rápidas, ya que las pequeñas partículas permiten una buena eficiencia con velocidades rápidas de la fase móvil (un centímetro por segundo o más). Esta técnica también es importante en la purificación, y las sustancias separadas pueden recogerse automáticamente después de la columna mediante un colector de fracciones.
Un procedimiento importante de cromatografía líquido-sólido es la cromatografía de fase inversa, en la que la fase móvil líquida es agua combinada con un disolvente orgánico como el metanol o el acetonitrilo y la superficie de la fase estacionaria es no polar o hidrocarbonada. A diferencia de la cromatografía de fase normal, en la que la superficie del adsorbente es polar, en la cromatografía de fase inversa la elución de las sustancias de la columna se realiza en orden de polaridad creciente. Además, la separación se basa en los aspectos no polares de las sustancias. En la separación de una serie de péptidos de la hormona de crecimiento humana, un fármaco fabricado recombinantemente, se utiliza una enzima, la tripsina, para romper los enlaces peptídicos que contienen los aminoácidos básicos -arganina y lisina- para obtener una huella digital específica de la proteína. El mapeo de péptidos es un método crítico para evaluar la pureza de sustancias complejas como las proteínas.
La cromatografía de intercambio iónico (CEI) es una subdivisión de la cromatografía líquido-sólido, pero su importancia es tal que merece una mención especial. Como su nombre indica, el proceso separa los iones; la base de la separación es la atracción variable de los diferentes iones de una solución hacia sitios con carga opuesta en una sustancia finamente dividida e insoluble (el intercambiador de iones, normalmente una resina sintética). En una resina de intercambio catiónico todos los sitios están cargados negativamente, por lo que sólo se pueden separar los iones positivos; una resina de intercambio aniónico tiene sitios cargados positivamente. La cromatografía de intercambio iónico se ha convertido en uno de los métodos más importantes para separar proteínas y pequeños oligonucleótidos.
Una aplicación importante del intercambio iónico es la eliminación de los iones de hierro, calcio y magnesio disueltos en el agua dura. Los sitios negativos de un intercambiador de cationes se neutralizan primero con iones de sodio mediante la exposición a una solución fuerte de sal común (cloruro de sodio); cuando el agua dura pasa por la resina, los iones indeseables del agua se sustituyen por iones de sodio.
La cromatografía de adsorción líquido-sólido también puede realizarse en placas finas y planas (cromatografía de capa fina, o TLC). La TLC es barata y rápida pero no es tan sensible o eficiente como la cromatografía en columna. En la práctica, el adsorbente se extiende sobre una placa de vidrio y se seca. La muestra se aplica como un punto cerca de un extremo de la placa, que se coloca (verticalmente) en un depósito poco profundo que contiene la fase móvil. A medida que la fase móvil asciende por la placa por acción capilar, la muestra se disuelve en el líquido y sus componentes son transportados por la placa a nuevas posiciones a distancias variables del punto de partida. (Para más información, véase el artículo sobre cromatografía).