リンパ球の採取
モノクローナル抗体の製造には、脾臓やリンパ節にある抗体産生細胞の採取が必要です。
ハイブリドーマ細胞を作るための融合
脾臓細胞は培養での生存期間が限られているため、試験管内で何度も継代できる不死化ハイブリッドを作るために、ミエローマ（癌性B細胞）と融合させることが必要です。 これは、ポリエチレングリコール（PEG）または電気パルスによって達成され、どちらも細胞膜を破壊し、隣接する2つの細胞の結合を可能にします
融合ハイブリッドの選択
B細胞とミエローマの融合は100％効率的ではありません。 したがって、骨髄腫-リンパ球のハイブリッドを選択することが必要である。 ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン培地（HAT）はアミノプテリンを介してDNA合成を阻害する。 B細胞や融合ハイブリッドは、チミジンキナーゼを持っているので、HAT培地での培養を克服し、HAT培地から供給されるチミジンから必要なDNAポリメラーゼ前駆体を合成することができる。 骨髄腫はチミジンキナーゼを産生しないので、HAT培地では生存できない。
限界希釈によるクローナリティの達成
選択から生き残った細胞集団は、標的抗原に特異的な複数のクローンと、無関係な特異性を持つ抗体を生成するクローンの両方を含む、依然として不均質な状態になっています。 クローナリティを確保するためには、単一細胞が必要であり、限界希釈によって達成される。 限界希釈は、統計的に各ウェルが1つの細胞を含むように、不均質な集団のプレーティング濃度を希釈する技術である。 実際には、あるウェルには全く細胞が含まれず、あるウェルには単一細胞が含まれ、またあるウェルには複数の細胞が含まれることがあります。 しかし、このプロセスを繰り返すことにより、各ウェルには1つの細胞しか含まれないことが確認され、同一のモノクローナル抗体を産生することができます。 各クローン候補は、抗原に対するELISAで上清をスクリーニングすることにより、最低限テストする必要があります。
拡大、凍結保存、生産、および精製
モノクローナル状態に達し、スクリーニングアッセイで成功した後、選択したハイブリドーマを拡大し、安全性と保存のために冗長ストックに凍結保存します。 これらのモノクローナル抗体ストックに戻ることで、バッチ間の一貫性と信頼性の高い抗体性能が可能になります。 抗体産生用のハイブリドーマは、宿主の腹膜に注入することにより、in vivoで増殖させることができます。 腹水製造として知られるこの単純な技術は、宿主動物にとって非常に不快である可能性があるため、人気がなくなってきています。 一方、ローラーボトル生産などの大規模なin vitro技術では、1リットル規模の生産が可能であり、腹水生産技術よりはるかに優れている。 最後に、限界希釈とスクリーニングの段階で他のすべての不要な免疫グロブリンが除去されているため、プロテインA/Gを介して免疫グロブリンを捕捉する単純な精製だけで、純粋な抗体を回収することができます
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