Lymphocyta gyűjtés
A monoklonális antitestek előállításához a lépben vagy a nyirokcsomókban található antitesttermelő sejtek gyűjtése szükséges.
Fúzió a hibridóma sejtek létrehozásához
Mivel a lépsejtek tenyészetben korlátozott túlélési idővel rendelkeznek, ezért myelomákkal, rákos B-sejtekkel kell fuzionálni őket, hogy egy immortalizált hibridet hozzanak létre, amely számos in vitro passzázson mehet keresztül. Ez polietilénglikollal (PEG) vagy elektromos impulzusokkal érhető el, amelyek mindkettő a sejtmembránt megbontja, és lehetővé teszi két szomszédos sejt összeolvadását.
A fúziós hibridek kiválasztása
A B-sejtek és a mielóma fúziója nem 100%-ban hatékony. Ezért szükséges a myeloma-limfocita hibridek szelektálása. A hipoxantin-aminopterin-timidin közeg (HAT) az aminopterin révén gátolja a DNS-szintézist. A B-sejtek és a fuzionált hibridek túl tudnak lépni a HAT-közegben történő tenyésztésen, mivel rendelkeznek timidin-kinázzal, amely lehetővé teszi számukra, hogy a szükséges DNS-polimeráz-prekurzorokat a HAT-közegből származó timidinből szintetizálják. A myelomák nem termelnek timidin-kinázt, és következésképpen nem maradnak életben HAT-közegben. Bár a halandó B-sejtek tartalmaznak timidin-kinázt, korlátozott in vitro replikációs képességük miatt végül elpusztulnak.
Klónalitás elérése korlátozó hígításokkal
A szelekciót túlélő sejtek populációja még mindig heterogén, tartalmaz a célantigénre specifikus többszörös klónokat és irreleváns specifitású antitesteket termelő klónokat is. A klonalitás biztosításához egyetlen sejtre van szükség, amit limitáló hígításokkal érünk el. A limitáló hígítás egy olyan technika, amely a heterogén populáció tenyésztési koncentrációját úgy hígítja, hogy statisztikailag minden egyes lyuk egy sejtet tartalmazzon. A gyakorlatban egyes kutak nem tartalmazhatnak sejteket, egyesek egyetlen sejtet, mások pedig több sejtet. Azonban a folyamat megismétlése a bővítési körök után biztosítja, hogy minden egyes kút csak egyetlen sejt bővítését tartalmazza, és így azonos monoklonális antitestek előállítását eredményezi. Minden potenciális klónt minimálisan az antigénnel szemben ELISA tesztelni kell a felülúszó szűréssel. A klónok szupernátuma a következő szakaszba lépés előtt specifikus alkalmazásokhoz is szűrhető.
Kiterjesztés, krioprezerválás, előállítás és tisztítás
A monoklonális státusz elérése és a szűrővizsgálatokban elért sikeres teljesítmény után a kiválasztott hibridómákat kiterjesztik és redundáns állományokban lefagyasztják megőrzés és tartósítás céljából. Az ilyen monoklonális antitestkészletekhez való visszatérés lehetővé teszi a tételenkénti konzisztenciát és a megbízható antitestteljesítményt. Az antitestek előállítására szolgáló hibridómák in vivo is kiterjeszthetők a gazdaszervezet hashártyájába történő befecskendezéssel. Ez az egyszerű, aszcitesztermelésnek nevezett technika kiment a divatból, mivel rendkívül kellemetlen lehet a gazdatest állat számára. Alternatív megoldásként nagyméretű in vitro technikák, mint például a roller-bottle termelés, literes nagyságrendű termelést tesznek lehetővé, ami messze felülmúlja az ascites technikákat. Végül, a tiszta ellenanyag kinyeréséhez csak egyszerű tisztítás szükséges az immunglobulin A/G fehérjén keresztül történő befogására, mivel az összes többi nem kívánt immunglobulin eltávolításra került a határhígítási és szűrési szakaszokban.