Lymphozyten-Ernte
Die Produktion von monoklonalen Antikörpern erfordert die Sammlung der Antikörper-produzierenden Zellen, die in der Milz oder Lymphknoten gefunden werden.
Fusion zur Erzeugung von Hybridomazellen
Da Milzzellen in Kultur nur eine begrenzte Überlebenszeit haben, müssen sie mit Myelomen, also krebsartigen B-Zellen, fusioniert werden, um einen unsterblichen Hybriden zu erzeugen, der viele Passagen in vitro durchlaufen kann. Dies wird durch Polyethylenglykol (PEG) oder elektrische Impulse erreicht, die beide die Zellmembran zerstören und die Verschmelzung zweier benachbarter Zellen ermöglichen.
Auswahl von fusionierten Hybriden
Die Fusion von B-Zellen und Myelomen ist nicht zu 100 % effizient. Daher ist eine Selektion auf Myelom-Lymphozyten-Hybride erforderlich. Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Medium (HAT) hemmt die DNA-Synthese über Aminopterin. B-Zellen und fusionierte Hybride können die Kultivierung in HAT-Medium überstehen, da sie Thymidin-Kinase besitzen, die es ihnen ermöglicht, die erforderlichen DNA-Polymerase-Vorstufen aus dem vom HAT-Medium gelieferten Thymidin zu synthetisieren. Myelome produzieren keine Thymidinkinase und können daher in HAT-Medium nicht überleben. Obwohl sterbliche B-Zellen Thymidinkinase enthalten, sterben sie schließlich aufgrund ihrer begrenzten In-vitro-Replikationsfähigkeit ab.
Erreichen der Klonalität mit begrenzten Verdünnungen
Die Zellpopulation, die die Selektion überlebt, ist immer noch heterogen und enthält sowohl multiple Klone, die spezifisch für das Zielantigen sind, als auch Klone, die Antikörper mit irrelevanter Spezifität produzieren. Um die Klonalität zu gewährleisten, werden einzelne Zellen benötigt, was durch limitierende Verdünnungen erreicht wird. Die limitierende Verdünnung ist eine Technik, bei der die Ausplattierungskonzentrationen der heterogenen Population so verdünnt werden, dass statistisch gesehen jede Vertiefung eine Zelle enthält. In der Praxis kann es vorkommen, dass einige Vertiefungen keine Zellen, andere eine einzelne Zelle und wieder andere mehrere Zellen enthalten. Durch die Wiederholung dieses Prozesses nach mehreren Expansionsrunden wird jedoch sichergestellt, dass jede Vertiefung nur die Expansion einer einzigen Zelle enthält und somit zur Produktion identischer monoklonaler Antikörper führt. Jeder potenzielle Klon sollte mindestens durch ein Überstandsscreening in einem ELISA gegen das Antigen getestet werden.
Expansion, Kryokonservierung, Produktion und Reinigung
Nach Erreichen des monoklonalen Status und erfolgreicher Leistung in Screening-Assays werden ausgewählte Hybridome expandiert und in redundanten Beständen zur Sicherung und Konservierung eingefroren. Der Rückgriff auf diese monoklonalen Antikörperbestände ermöglicht die Konsistenz von Charge zu Charge und eine zuverlässige Antikörperleistung. Hybridome für die Antikörperproduktion können in vivo durch Injektion in das Peritoneum eines Wirts expandiert werden. Diese einfache Technik, die als Aszites-Produktion bekannt ist, ist in Verruf geraten, da sie für das Wirtstier äußerst unangenehm sein kann. Alternativ dazu ermöglichen groß angelegte In-vitro-Techniken wie die Produktion in Rollerbehältern eine Produktion im Liter-Maßstab, die die Aszites-Techniken weit übertrifft. Schließlich ist eine einfache Reinigung zur Abtrennung von Immunglobulin über Protein A/G alles, was zur Gewinnung reiner Antikörper erforderlich ist, da alle anderen unerwünschten Immunglobuline in den Phasen der Grenzverdünnung und des Screenings entfernt wurden.