Sběr lymfocytů
Výroba monoklonálních protilátek vyžaduje odběr buněk produkujících protilátky, které se nacházejí ve slezině nebo lymfatických uzlinách.
Fúze k vytvoření hybridomových buněk
Jelikož mají buňky sleziny omezenou dobu přežití v kultuře, vyžadují fúzi s myelomy, rakovinnými B-buňkami, aby vznikl imortalizovaný hybrid, který může projít mnoha pasážemi in vitro. Toho se dosahuje pomocí polyetylenglykolu (PEG) nebo elektrických pulzů, které oba narušují buněčnou membránu a umožňují splynutí dvou sousedních buněk.
Výběr fúzovaných hybridů
Fúze B-buněk a myelomu není stoprocentně účinná. Proto je nutná selekce myelomových a lymfocytárních hybridů. Hypoxantin-aminopterin-thymidinové médium (HAT) inhibuje syntézu DNA prostřednictvím aminopterinu. B-buňky a fúzované hybridy mohou překonat kultivaci v médiu HAT, protože mají thymidinkinázu, která jim umožňuje syntetizovat potřebné prekurzory DNA polymerázy z thymidinu dodávaného médiem HAT. Myelomy thymidinkinázu neprodukují, a proto v médiu HAT nepřežívají. Smrtelné B-buňky sice obsahují tymidinkinázu, ale nakonec odumírají kvůli omezené schopnosti replikace in vitro.
Dosažení klonality při limitním ředění
Populace buněk, které přežijí selekci, je stále heterogenní a obsahuje jak více klonů specifických pro cílový antigen, tak klony produkující protilátky s irelevantní specifitou. K zajištění klonality jsou zapotřebí jednotlivé buňky, kterých se dosahuje pomocí limitujících ředění. Limitní ředění je technika, která ředí koncentraci heterogenní populace tak, aby statisticky každá jamka obsahovala jednu buňku. V praxi mohou některé jamky obsahovat žádné buňky, některé jednu buňku a jiné více buněk. Opakování tohoto postupu po kolech expanze však zajistí, že každá jamka obsahuje pouze expanzi jedné buňky, a proto vede k produkci identických monoklonálních protilátek. Každý potenciální klon by měl být minimálně testován pomocí screeningu supernatantu v testu ELISA proti antigenu. Supernatant klonů může být před přechodem do další fáze rovněž podroben screeningu pro specifické aplikace.
Expanze, kryokonzervace, výroba a purifikace
Po dosažení monoklonálního statusu a úspěšném výkonu ve screeningových testech se vybrané hybridomy expandují a zmrazí v nadbytečných zásobách pro zabezpečení a konzervaci. Návrat k těmto monoklonálním zásobám protilátek umožňuje konzistenci jednotlivých šarží a spolehlivou výkonnost protilátek. Hybridomy pro výrobu protilátek lze expandovat in vivo injekcí do peritonea hostitele. Tato jednoduchá technika známá jako produkce ascitu upadla v nemilost, protože může být pro hostitelské zvíře velmi nepříjemná. Alternativou jsou rozsáhlé techniky in vitro, jako je produkce v lahvích, které umožňují produkci v litrovém měřítku, což je mnohem lepší než techniky s ascitem. A konečně, k získání čisté protilátky stačí jednoduchá purifikace k zachycení imunoglobulinu prostřednictvím proteinu A/G, protože všechny ostatní nežádoucí imunoglobuliny byly odstraněny ve fázích limitního ředění a screeningu.