30.4.2 Why exclusion?
Variëte mechanismen die ten grondslag liggen aan SIE zijn voorgesteld (Zhou en Zhou, 2012). Drie hypothesen verdienen nadere aandacht. (1) Het secundaire virus komt een cel binnen die al bezet is door het primaire virus. Hierbij zijn de volgende gebeurtenissen mogelijk: (a) overgeëxpresseerd CP van het primaire virus verhindert de ontmanteling van het secundaire virus (Beachy et al., 1990; Lu et al, 1998); (b) ongecoat, en daardoor onbeschermd, RNA van het secundaire virus wordt afgebroken door het RNA-geïnduceerd silencing complex (RISC) van het primaire virus; (c) het negatief-strengs RNA van het primaire virus hybridiseert met het secundaire virus RNA, waarna de dubbelstrengs RNA (dsRNA) hybriden worden onderworpen aan Dicer-gemedieerde splitsing, wat resulteert in de generatie van siRNA’s (Fig. 30.4). (2) Het secundaire virus komt in cellen die eerder met siRNA zijn geprimed, maar geen RNA van het primaire virus bevatten. In dit geval richt RISC zich tegen het RNA van het secundaire virus, waardoor het wordt afgebroken. (3) Het secundaire virus dringt cellen binnen die ver verwijderd zijn van de geïnfecteerde cellen. Hier wordt een lange-afstandssignaal uitgezonden om de silencing-respons te versterken door het endogene RNA-afhankelijke RNA-polymerase (RdRp), dat in staat is RISC te activeren en het RNA van de nieuwe incomer af te breken.
De hypothese over CP-gemedieerde SIE berustte sterk op de bevinding dat transgene N. tabacum en N. benthamiana planten die de CP van TMV tot expressie brengen weerstand vertoonden tegen infectie met dit virus, hetgeen suggereert dat CP interfereert met de uncoating van TMV-deeltjes in de cel (Beachy et al, 1990; Lu et al., 1998). De verantwoordelijkheid van dit mechanisme alleen voor SIE is echter betwistbaar, vooral omdat is aangetoond dat SIE met succes wordt overgedragen door CP-defecte virusvarianten en viroïden (Gal-On en Shiboleth, 2006). De CP-onafhankelijke SIE tussen gedeconstrueerde varianten van TMV kan in N. benthamiana werken als een vroeg geïnduceerd en zich snel verspreidend mechanisme (Julve et al., 2013). In een gedeconstrueerde variant worden ongewenste genoomfuncties verwijderd en wordt het virus opnieuw geassembleerd door ofwel de ontbrekende functies over te dragen aan de gastheer of ze te vervangen door analoge functies die niet van een virus afkomstig zijn. Tarweplanten geïnfecteerd met TriMV die WSMV NIa-Pro of CP tot expressie brengen, waren aanzienlijk beschermd tegen superinfectie door groen fluorescerend eiwit-getagd WSMV (WSMV-GFP), wat suggereert dat deze beide cistrons SIE-effectoren zijn die door WSMV worden gecodeerd (Tatineni en French, 2016). Verder toonde deletiemutagenese aan dat voor het uitlokken van SIE door NIa-Pro het volledige eiwit nodig is, terwijl CP slechts een 200-aminozuur middenfragment van het 349-aminozuur eiwit nodig heeft. Interessant is dat wederkerige experimenten met WSMV-gemedieerde expressie van TriMV-eiwitten aantoonden dat, op een vergelijkbare manier, zowel TriMV CP als TriMV NIa-Pro superinfectie door TriMV-GFP uitsloten. Hieruit kan worden geconcludeerd dat WSMV- en TriMV-gecodeerde CP- en NIa-Pro-eiwitten in staat zijn om resistentie tegen superinfectie teweeg te brengen en dat deze twee eiwitten onafhankelijk van elkaar SIE uitlokken (Tatineni en French, 2016).
Systemische silencing, die een substantiële rol speelt in de derde hypothese, kan helpen om de verschijnselen van “herstel” en “groene eilanden” te begrijpen, die worden waargenomen in sommige natuurlijke infecties en in transgene planten die van het virus afgeleide transgenen tot expressie brengen. Het fenomeen van herstel, dat wordt gekenmerkt door een aanvankelijke ernstige reactie van planten op virale infectie gevolgd door een vermindering van zowel de ernst van de symptomen als het niveau van RNA in jonge bovenste bladeren, is bekend dat het bij veel plantensoorten voorkomt (Nie en Molen, 2015). In PVY-geïnfecteerde tabaksplanten, interfereerde het verwijderen van de eerste drie bladeren boven de geïnoculeerde bladeren met het optreden van herstel, wat erop zou kunnen wijzen dat het signaal dat het herstel medieert in deze bladeren wordt gegenereerd. Interessant en onverwacht werd het verminderde niveau van PVY RNA in de bovenste bladeren ook waargenomen in tomaat, maar niet in aardappelplanten.
Zoals opgemerkt door Ziebell en Carr (2010), zou de hypothese waarbij RNA silencing optreedt een plausibele verklaring bieden voor het feit dat SIE alleen optreedt tussen nauw verwante virusstammen/isolaten en een tijdsinterval tussen de inoculaties nodig heeft. Een recenter mechanistisch model gepostuleerd door Zhang et al. (2018) voor RNA-virussen gaat ervan uit dat SIE een virale functie manifesteert die voorkomt dat nakomelingengenomen zich opnieuw vermenigvuldigen in de cellen van hun ouders, en dat het collateraal gericht is op zeer homologe superinfecterende virussen die niet te onderscheiden zijn van nakomelingenvirussen. Verder wordt voorgesteld dat SIE evolutionair kan worden geselecteerd om een optimale foutfrequentie in progeny-genomen te behouden.
In de afgelopen jaren zijn een aantal opmerkelijke proeven uitgevoerd waarin deep sequencing en bioinformatische analyse van kleine RNA-populaties (sRNA-omics) niet alleen werden gebruikt voor de diagnose van RNA- en DNA-virussen en de reconstructie van hun genomen, maar ook voor de reconstructie van viromen in gemengde infecties (gerecenseerd in Pooggin, 2018). De sRNA-omics-benadering maakt gebruik van een op RNAi-gebaseerd antiviraal afweersysteem waarbij siRNA’s worden gegenereerd. In een kruisbeschermingsexperiment met tomaten werd een milde stam CH2 van het pepinomozaïekvirus (PepMV; Potexvirus, Alphaflexiviridae) getest op bescherming tegen stam LP van hetzelfde virus (Turco et al., 2018). Wederkerige inoculaties resulteerden in een dubbele infectie van alle individuele planten met CH2- en LP-stammen, gereconstrueerd als afzonderlijke sRNA-contigs. De invasie van CH2-gepreïnfecteerde planten door stam LP, en vice versa, ging gepaard met veranderingen van consensus genoomsequenties in virale quasi-soorten. Deze bevindingen kunnen erop wijzen dat het gebruik van kruisprotectie als een manier om plantenvirusziekten onder controle te houden, met grote risico’s gepaard kan gaan.
Een zwak punt van de sRNA-omics-benadering is het onvermogen om genoomsequenties van twee of meer virale stammen of genetische varianten met een hoge sequentie-identiteit volledig te reconstrueren. Een casestudie uitgevoerd door Turco et al. (2018) op een natuurlijk geïnfecteerde aardappelplant bracht een viroom aan het licht dat bestond uit NTN- en O-stammen van PVY, waarvan de sRNA’s zich assembleerden tot chimere contigs, die konden worden ontleed door ze te vergelijken met de referentiegenoomsequenties. Twee c-o-infecterende stammen konden alleen de novo tot stam-specifieke sRNA-contigs worden geassembleerd voor een 1-kb 5′-gedeelte van de virale genomen, die 75% nucleotide-identiteit vertonen. De resterende delen van de genomen, die meer dan 87% identiteit delen, fuseerden tot één chimere kleine RNA-contig en konden alleen worden gescheiden door een op referentie gebaseerde genoomassemblage. Pooggin (2018) wijst erop dat in de bovengenoemde en soortgelijke gevallen recombinante virale genomen die mogelijk aanwezig zijn in de gemengde virome quasi-species populatie niet betrouwbaar kunnen worden gereconstrueerd op basis van small RNA reads.
Het moet worden benadrukt dat er verschillende cellulaire silencing pathways zijn naast de pathways die betrokken zijn bij verdediging (Brodersen en Voinnet, 2006; Zhang en Qu, 2016). Zhang et al. (2015) hebben gerapporteerd dat zowel wild-type als RNA silencing-defecte Arabidopsis en N. benthamiana planten een vergelijkbaar patroon vertoonden van willekeurige dominantie door verschillende variant genotypen van turnip crinkle virus (TCV; Carmovirus, Tombusviridae). Deze bevinding kan erop wijzen dat, ondanks de afhankelijkheid van zowel RNA silencing en SIE op hoge sequentie gelijkenis tussen de inducer en het challenge virus, er een ander mechanisme achter kruisbescherming zit, verschillend van RNA silencing, dat nog moet worden opgehelderd.