30.4.2 Varför uteslutning?
Flera olika mekanismer som ligger till grund för SIE har föreslagits (Zhou och Zhou, 2012). Tre hypoteser förtjänar närmare uppmärksamhet. (1) Det sekundära viruset kommer in i en cell som redan är upptagen av det primära viruset. Här är följande händelser möjliga: (a) Överuttryckt CP av det primära viruset förhindrar det sekundära virusets nedmontering (Beachy et al., 1990; Lu et al, 1998); b) det sekundära virusets RNA utan beläggning och därmed oskyddat bryts ned av det primära virusets RNA-inducerade tystnadskomplex (RISC); c) det primära virusets negativt strängade RNA hybridiserar med det sekundära virusets RNA, varefter de dubbelsträngade RNA-hybriderna (dsRNA) utsätts för en Dicer-medierad klyvning, vilket resulterar i generering av siRNA (fig. 30.4). (2) Det sekundära viruset går in i celler som tidigare har primat med siRNA, men som inte innehåller RNA från det primära viruset. I detta fall riktar sig RISC mot det sekundära virusets RNA och orsakar dess nedbrytning. (3) Det sekundära viruset går in i celler som ligger långt från de infekterade cellerna. Här sänds en långdistanssignal för att förstärka tystnadssvaret av det endogena RNA-beroende RNA-polymeraset (RdRp), som kan aktivera RISC och bryta ned det nya inkommande virusets RNA.
Hypotesen om CP-medierad SIE byggde starkt på upptäckten att transgena N. tabacum och N. benthamiana plantor som uttryckte TMV:s CP visade resistens mot infektion med detta virus, vilket tyder på att CP störde upplösningen av TMV-partiklar inne i cellen (Beachy et al, 1990; Lu et al., 1998). Man kan dock ifrågasätta om denna mekanism är ensam ansvarig för SIE, framför allt eftersom SIE har visat sig kunna ges med framgång av CP-defekta virusvarianter och viroider (Gal-On och Shiboleth, 2006). Den CP-oberoende SIE mellan dekonstruerade varianter av TMV kan fungera i N. benthamiana som en tidigt inducerad och snabbt spridande mekanism (Julve et al., 2013). I en dekonstruerad variant avlägsnas oönskade genomfunktioner och viruset återmonteras genom att antingen överföra de saknade funktionerna till värden eller ersätta dem med analoga funktioner som inte kommer från ett virus. Veteplantor som infekterats med TriMV som uttrycker WSMV NIa-Pro eller CP skyddades avsevärt från superinfektion med grönt fluorescerande proteinmärkt WSMV (WSMV-GFP), vilket tyder på att båda dessa cistrons är SIE-effektorer som kodas av WSMV (Tatineni och French, 2016). Vidare visade deletionsmutationer att framkallande av SIE av NIa-Pro kräver hela proteinet, medan CP endast behöver ett mittfragment på 200 aminosyror av det 349 aminosyror stora proteinet. Intressant nog visade ömsesidiga experiment med WSMV-medierat uttryck av TriMV-proteiner att både TriMV CP och TriMV NIa-Pro på liknande sätt uteslöt superinfektion med TriMV-GFP. Man kan dra slutsatsen att WSMV- och TriMV-kodade CP- och NIa-Pro-proteiner kan utlösa resistens mot superinfektion och att dessa två proteiner framkallar SIE oberoende av varandra (Tatineni och French, 2016).
Systemisk tystnad, som spelar en väsentlig roll i den tredje hypotesen, kan hjälpa till att förstå fenomenen ”återhämtning” och ”gröna öar” som observeras i vissa naturliga infektioner och i transgena växter som uttrycker virusavledda transgener. Återhämtningsfenomenet, som kännetecknas av en inledande allvarlig reaktion hos växter på virusinfektion som följs av en minskning av både symtomens allvarlighetsgrad och nivån av RNA i unga övre blad, är känt för att förekomma i många växtarter (Nie och Molen, 2015). I PVY-infekterade tobaksplantor störde avlägsnandet av de tre första bladen ovanför de inokulerade bladen förekomsten av återhämtning, vilket kan tyda på att signalen som medierar återhämtningen genereras i dessa blad. Intressant nog, och oväntat nog, observerades den minskade nivån av PVY-RNA i de övre bladen även i tomat, men inte i potatisplantor.
Som Ziebell och Carr (2010) påpekade skulle hypotesen som involverar RNA-silensering ge en rimlig förklaring till varför SIE endast förekommer mellan närbesläktade virusstammar/isolat och behöver ett tidsintervall mellan inokuleringarna. En nyare mekanistisk modell som postulerats av Zhang et al. (2018) för RNA-virus utgår från att SIE manifesterar en virusfunktion som förhindrar att avkomman genomer återreplikeras i sina föräldrars celler, och att den kollateralt riktar sig mot mycket homologa superinfekterande virus som inte går att skilja från avkomman virus. Det föreslås vidare att SIE kan vara evolutionärt selekterad för att upprätthålla en optimal felfrekvens i progeny genomer.
Under de senaste åren har ett antal anmärkningsvärda försök genomförts där djupsekvensering och bioinformatisk analys av små RNA-populationer (sRNA-omics) har använts inte bara för att diagnostisera RNA- och DNA-virus och rekonstruera deras genomer, utan också för att rekonstruera viromerna i blandade infektioner (granskad i Pooggin, 2018). I sRNA-omics-metoden används ett RNAi-baserat antiviralt försvarssystem som inbegriper generering av siRNAs. I ett korsskyddsexperiment med tomater testades en mild stam CH2 av pepinomosaikvirus (PepMV; Potexvirus, Alphaflexiviridae) för skydd mot stam LP av samma virus (Turco et al., 2018). Ömsesidiga inokulationer resulterade i dubbelinfektion av alla enskilda plantor med CH2- och LP-stammar, som rekonstruerades som separata sRNA-contigs. Invasionen av CH2-preinfekterade plantor av stam LP, och vice versa, åtföljdes av förändringar av konsensusgenomsekvenser i virala kvasi-arter. Dessa resultat kan tyda på att användningen av korsskydd som ett sätt att kontrollera växtvirussjukdomar kan vara behäftad med höga risker.
En svag punkt i sRNA-omics-metoden är dess oförmåga att fullständigt rekonstruera genomsekvenser av två, eller flera, virusstammar eller genetiska varianter som uppvisar hög sekvensidentitet. En fallstudie utförd av Turco et al. (2018) på en naturligt infekterad potatisplanta avslöjade ett virom som omfattade NTN- och O-stammar av PVY, vars sRNA:er samlades till chimära contigs, som kunde avvecklas genom att jämföras med referensgenomsekvenserna. Två c-infekterande stammar kunde endast assembleras de novo till stamspecifika sRNA-contigs för en 1 kb 5′-del av virusgenomerna, som delar 75 % nukleotididentitet. De återstående delarna av genomerna, som delar mer än 87 % identitet, smälte samman till en chimär liten RNA-kontig och kunde endast separeras med hjälp av en referensbaserad genomsammansättning. Pooggin (2018) påpekar att i ovan nämnda och liknande fall kan rekombinanta virala genomer som potentiellt finns i den blandade viromkvasi-artspopulationen inte på ett tillförlitligt sätt rekonstrueras från små RNA-läsningar.
Det bör understrykas att det finns flera cellulära ljuddämpningsvägar utöver de som är involverade i försvaret (Brodersen och Voinnet, 2006; Zhang och Qu, 2016). Zhang et al. (2015) har rapporterat att både vildtyp och RNA silencing-defekta Arabidopsis- och N. benthamiana-plantor uppvisade ett liknande mönster av slumpmässig dominans av flera variantgenotyper av turnip crinkle virus (TCV; Carmovirus, Tombusviridae). Detta resultat kan tyda på att det, trots att både RNA-silencing och SIE är beroende av hög sekvenslikhet mellan induceraren och utmaningsviruset, finns en annan mekanism bakom korsskydd, som skiljer sig från RNA-silencing, och som väntar på att bli klarlagd.