30.4.2 ¿Por qué la exclusión?
Se han propuesto diversos mecanismos subyacentes a la SIE (Zhou y Zhou, 2012). Tres hipótesis merecen una mayor atención. (1) El virus secundario entra en una célula que ya está ocupada por el virus primario. En este caso, son posibles los siguientes acontecimientos (a) la CP sobreexpresada del virus primario impide el desmontaje del virus secundario (Beachy et al., 1990; Lu et al., 1998); (b) el ARN no recubierto, y por tanto desprotegido, del virus secundario es degradado por el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) del virus primario; (c) el ARN de cadena negativa del virus primario se hibrida con el ARN del virus secundario, tras lo cual los híbridos de ARN de doble cadena (ARNd) se someten a la escisión mediada por Dicer, lo que da lugar a la generación de ARNsi (Fig. 30.4). (2) El virus secundario entra en células previamente cebadas por ARNsi, pero que no contienen ARN del virus primario. En este caso, el RISC se dirige al ARN del virus secundario, provocando su degradación. (3) El virus secundario entra en células distantes de las células infectadas. Aquí, se envía una señal de larga distancia para amplificar la respuesta de silenciamiento por parte de la ARN polimerasa dependiente de ARN endógena (RdRp), que es capaz de activar RISC y degradar el ARN del nuevo entrante.
La hipótesis sobre el SIE mediado por CP se basó fuertemente en el hallazgo de que los transgénicos N. tabacum y N. benthamiana transgénicas que expresan el CP del TMV mostraron resistencia a la infección con este virus, lo que sugiere que el CP interfiere con el desrevestimiento de las partículas del TMV dentro de la célula (Beachy et al, 1990; Lu et al., 1998). Sin embargo, la responsabilidad exclusiva de este mecanismo para el SIE es discutible, principalmente porque se ha demostrado que el SIE es conferido con éxito por variantes virales y viroides defectuosos de CP (Gal-On y Shiboleth, 2006). El SIE independiente del CP entre variantes deconstruidas de TMV puede operar en N. benthamiana como un mecanismo de inducción temprana y de rápida propagación (Julve et al., 2013). En una variante deconstruida, las funciones no deseadas del genoma se eliminan y el virus se vuelve a ensamblar transfiriendo las funciones que faltan al huésped o sustituyéndolas por funciones análogas que no provienen de un virus. Las plantas de trigo infectadas con TriMV que expresan WSMV NIa-Pro o CP estaban sustancialmente protegidas de la superinfección por WSMV marcado con proteína verde fluorescente (WSMV-GFP), lo que sugiere que ambos cistrones son efectores SIE codificados por WSMV (Tatineni y French, 2016). Además, la mutagénesis de deleción reveló que la elicitación de SIE por NIa-Pro requiere toda la proteína, mientras que CP sólo necesita un fragmento medio de 200 aminoácidos de la proteína de 349 aminoácidos. Curiosamente, los experimentos recíprocos con la expresión mediada por el WSMV de las proteínas del TriMV mostraron que, de forma similar, tanto el TriMV CP como el TriMV NIa-Pro excluyeron la superinfección por el TriMV-GFP. Se puede concluir que las proteínas CP y NIa-Pro codificadas por el WSMV y el TriMV son capaces de desencadenar la resistencia a la superinfección y que estas dos proteínas elicitan la SIE de forma independiente entre sí (Tatineni y French, 2016).
El silenciamiento sistémico, que desempeña un papel sustancial en la tercera hipótesis, puede ayudar a entender los fenómenos de «recuperación» e «islas verdes», observados en algunas infecciones naturales y en plantas transgénicas que expresan transgenes derivados del virus. Se sabe que el fenómeno de recuperación, que se caracteriza por una respuesta inicial grave de las plantas a la infección viral, seguida de una reducción tanto de la gravedad de los síntomas como del nivel de ARN en las hojas superiores jóvenes, se produce en muchas especies de plantas (Nie y Molen, 2015). En las plantas de tabaco infectadas por PVY, la eliminación de las tres primeras hojas por encima de las hojas inoculadas interfirió con la aparición de la recuperación, lo que podría indicar que la señal que media la recuperación se genera en estas hojas. Curiosamente, y de forma inesperada, el nivel reducido de ARN del PVY en las hojas superiores también se observó en las plantas de tomate, pero no en las de patata.
Como señalaron Ziebell y Carr (2010), la hipótesis que implica el silenciamiento del ARN proporcionaría una explicación plausible de por qué el SIE se produce sólo entre cepas/aislados del virus estrechamente relacionados y necesita un intervalo de tiempo entre inoculaciones. Un modelo mecanístico más reciente postulado por Zhang et al. (2018) para los virus de ARN supone que el SIE manifiesta una función viral que impide que los genomas de la progenie se vuelvan a replicar en las células de sus progenitores, y se dirige colateralmente a los virus superinfectantes altamente homólogos que son indistinguibles de los virus de la progenie. Se propone además que la SIE puede ser seleccionada evolutivamente para mantener una frecuencia de error óptima en los genomas de la progenie.
En los últimos años, se han llevado a cabo una serie de ensayos notables en los que se utilizó la secuenciación profunda y el análisis bioinformático de la población de ARN pequeños (sRNA-omics) no solo para el diagnóstico de los virus de ARN y ADN y la reconstrucción de sus genomas, sino también para reconstruir los viromos en infecciones mixtas (revisado en Pooggin, 2018). El enfoque sRNA-omics utiliza un sistema de defensa antiviral basado en el RNAi que implica la generación de siRNAs. En un experimento de protección cruzada con tomates, se probó la protección de una cepa suave CH2 del virus del mosaico del pepino (PepMV; Potexvirus, Alphaflexiviridae) contra la cepa LP del mismo virus (Turco et al., 2018). Las inoculaciones recíprocas dieron lugar a una infección dual de todas las plantas individuales con las cepas CH2 y LP, reconstruidas como contigs de ARNs separados. La invasión de las plantas preinfectadas con CH2 por la cepa LP, y viceversa, estuvo acompañada de alteraciones de las secuencias genómicas de consenso en las cuasiespecies virales. Estos hallazgos pueden indicar que el uso de la protección cruzada como forma de controlar las enfermedades de los virus de las plantas puede estar cargado de un alto riesgo.
Un punto débil del enfoque sRNA-omics es su incapacidad para reconstruir completamente las secuencias del genoma de dos, o más, cepas virales o variantes genéticas que muestran una alta identidad de secuencia. Un estudio de caso llevado a cabo por Turco et al. (2018) en una planta de patata infectada de forma natural reveló un virome que comprendía cepas NTN y O de PVY, cuyos sRNAs se ensamblaron en contigs quiméricos, que pudieron ser desenmarañados mediante la comparación con las secuencias del genoma de referencia. Dos cepas c-oinfectantes sólo pudieron ensamblarse de novo en contigs de ARNs específicos de la cepa para una porción de 1 kb 5′ de los genomas virales, que comparten un 75% de identidad de nucleótidos. Las partes restantes de los genomas, que comparten más del 87% de identidad, se fusionaron en un contig de ARN pequeño quimérico y solo pudieron separarse mediante un ensamblaje del genoma basado en la referencia. Pooggin (2018) señala que en el caso mencionado y en otros similares, los genomas virales recombinantes potencialmente presentes en la población mixta de cuasiespecies del viromo no pueden reconstruirse de forma fiable a partir de las lecturas de ARN pequeño.
Cabe destacar que existen varias vías de silenciamiento celular además de las implicadas en la defensa (Brodersen y Voinnet, 2006; Zhang y Qu, 2016). Zhang et al. (2015) han informado de que tanto las plantas de Arabidopsis y N. benthamiana de tipo salvaje como las defectuosas en cuanto al silenciamiento del ARN mostraron un patrón similar de dominancia aleatoria por parte de varios genotipos variantes del virus del nabo (TCV; Carmovirus, Tombusviridae). Este hallazgo puede indicar que, a pesar de la dependencia tanto del silenciamiento del ARN como del SIE de una alta similitud de secuencia entre el inductor y el virus de desafío, hay otro mecanismo detrás de la protección cruzada, distinto del silenciamiento del ARN, que espera ser dilucidado.