30.4.2 Why exclusion?
Zaproponowano różne mechanizmy leżące u podstaw SIE (Zhou i Zhou, 2012). Trzy hipotezy zasługują na bliższą uwagę. (1) Wirus wtórny wnika do komórki, która jest już zajęta przez wirusa pierwotnego. W tym przypadku możliwe są następujące zdarzenia: (a) nadekspresja CP wirusa pierwotnego uniemożliwia rozpad wirusa wtórnego (Beachy i in., 1990; Lu i in., 1998); (b) niepowlekany, a tym samym niechroniony RNA wirusa wtórnego jest degradowany przez kompleks wyciszający indukowany przez RNA (RISC) wirusa pierwotnego; (c) RNA ujemnej nici wirusa pierwotnego hybrydyzuje do RNA wirusa wtórnego, po czym hybrydy dwuniciowego RNA (dsRNA) poddawane są rozszczepieniu przez Dicer, co prowadzi do wytworzenia siRNA (rys. 30.4). (2) Wirus wtórny dostaje się do komórek uprzednio zagruntowanych przez siRNA, ale nie zawierających RNA wirusa pierwotnego. W tym przypadku RISC celuje w RNA wirusa wtórnego, powodując jego degradację. (3) Wirus wtórny dostaje się do komórek odległych od komórek zakażonych. W tym przypadku wysyłany jest sygnał o dużym zasięgu, aby wzmocnić odpowiedź wyciszającą przez endogenną polimerazę RNA zależną od RNA (RdRp), która jest w stanie aktywować RISC i degradować RNA nowego incomera.
Hipoteza o CP-mediowanym SIE silnie opierała się na odkryciu, że transgeniczne N. tabacum i N. benthamiana wyrażające CP wirusa TMV wykazywały odporność na infekcję tym wirusem, co sugeruje, że CP zakłóca rozpakowywanie cząstek TMV wewnątrz komórki (Beachy i in., 1990; Lu i in., 1998). Jednak wyłączna odpowiedzialność tego mechanizmu za powstawanie SIE jest dyskusyjna, głównie dlatego, że wykazano, że SIE może być z powodzeniem nadawany przez warianty i wiroidy wirusowe z defektem CP (Gal-On i Shiboleth, 2006). Niezależne od CP SIE pomiędzy zdekonstruowanymi wariantami TMV może działać w N. benthamiana jako mechanizm wczesnej indukcji i szybkiego rozprzestrzeniania się (Julve i in., 2013). W zdekonstruowanym wariancie, niepożądane funkcje genomu są usuwane, a wirus jest ponownie montowany poprzez przeniesienie brakujących funkcji do gospodarza lub zastąpienie ich analogicznymi funkcjami, które nie pochodzą od wirusa. Rośliny pszenicy zakażone TriMV z ekspresją WSMV NIa-Pro lub CP były znacząco chronione przed superinfekcją przez znakowany zieloną fluorescencją białek WSMV (WSMV-GFP), co sugeruje, że oba te cystrony są efektorami SIE kodowanymi przez WSMV (Tatineni i French, 2016). Co więcej, mutageneza delecyjna ujawniła, że elicytacja SIE przez NIa-Pro wymaga całego białka, podczas gdy CP potrzebuje jedynie 200-aminokwasowego środkowego fragmentu 349-aminokwasowego białka. Co ciekawe, wzajemne eksperymenty z ekspresją białek TriMV przez WSMV wykazały, że w podobny sposób zarówno TriMV CP jak i TriMV NIa-Pro wykluczały superinfekcję przez TriMV-GFP. Można wnioskować, że WSMV- i TriMV-encoded CP and NIa-Pro proteins are able to trigger resistance to superinfection and that these two proteins elicit SIE independently of each other (Tatineni and French, 2016).
Systemic silencing, which plays a substantial role in the third hypothesis, may help to understand the phenomena of „recovery” and „green islands”, observed in some natural infections and in transgenic plants expressing virus-derived transgenes. Zjawisko regeneracji, które charakteryzuje się początkową ostrą odpowiedzią roślin na infekcję wirusową, po której następuje redukcja zarówno nasilenia objawów, jak i poziomu RNA w młodych, górnych liściach, jest znane z występowania u wielu gatunków roślin (Nie i Molen, 2015). W roślinach tytoniu zakażonych PVY, usunięcie trzech pierwszych liści powyżej liści inokulowanych zakłóciło wystąpienie regeneracji, co może wskazywać, że sygnał pośredniczący w regeneracji jest generowany w tych liściach. Co ciekawe i niespodziewane, obniżony poziom PVY RNA w górnych liściach obserwowano również u pomidora, ale nie u ziemniaka.
Jak wskazują Ziebell i Carr (2010), hipoteza zakładająca wyciszanie RNA stanowiłaby wiarygodne wyjaśnienie, dlaczego SIE występuje tylko pomiędzy blisko spokrewnionymi szczepami/izolatami wirusa i wymaga odstępu czasowego pomiędzy inokulacjami. Nowszy model mechanistyczny postulowany przez Zhang i wsp. (2018) dla wirusów RNA zakłada, że SIE przejawia funkcję wirusową, która zapobiega ponownej replikacji genom potomnym w komórkach ich rodziców, i jest skierowana przeciw wysoce homologicznym wirusom superinfekcyjnym, które są nieodróżnialne od wirusów potomnych. Proponuje się ponadto, że SIE może być ewolucyjnie wyselekcjonowany w celu utrzymania optymalnej częstotliwości błędów w genomach potomnych.
W ostatnich latach przeprowadzono szereg wartych uwagi badań, w których głębokie sekwencjonowanie i analiza bioinformatyczna populacji małych RNA (sRNA-omika) zostały wykorzystane nie tylko do diagnostyki wirusów RNA i DNA oraz rekonstrukcji ich genomów, ale także do rekonstrukcji wirusów w infekcjach mieszanych (recenzja w Pooggin, 2018). Podejście sRNA-omics wykorzystuje system obrony przeciwwirusowej oparty na RNAi, polegający na generowaniu siRNA. W doświadczeniu ochrony krzyżowej z pomidorami, łagodny szczep CH2 wirusa mozaiki pepino (PepMV; Potexvirus, Alphaflexiviridae) był testowany pod kątem ochrony przed szczepem LP tego samego wirusa (Turco i in., 2018). Wzajemne inokulacje skutkowały podwójną infekcją wszystkich pojedynczych roślin szczepami CH2 i LP, zrekonstruowanymi jako oddzielne kontigi sRNA. Inwazji roślin preinfekowanych CH2 przez szczep LP, i odwrotnie, towarzyszyły zmiany konsensusowych sekwencji genomowych w wirusowych quasi-gatunkach. Wyniki te mogą wskazywać, że stosowanie ochrony krzyżowej jako sposobu zwalczania chorób wirusowych roślin może być obarczone dużym ryzykiem.
Słabą stroną podejścia sRNA-omiki jest niemożność całkowitej rekonstrukcji sekwencji genomowych dwóch lub więcej szczepów wirusowych lub wariantów genetycznych wykazujących wysoką identyczność sekwencji. Studium przypadku przeprowadzone przez Turco i wsp. (2018) na naturalnie zakażonej roślinie ziemniaka ujawniło virom obejmujący szczepy NTN i O PVY, których sRNA składały się w chimeryczne kontigi, które można było rozczłonkować poprzez porównanie z referencyjnymi sekwencjami genomu. Dwa szczepy c-oinfekcyjne mogły być połączone de novo w specyficzne dla szczepu kontigi sRNA tylko dla 1-kb 5′ części genomów wirusowych, które mają 75% identyczności nukleotydów. Pozostałe części genomów, dzielące ponad 87% identyczności, zlały się w jeden chimeryczny kontig małego RNA i mogły być rozdzielone tylko przez referencyjne złożenie genomu. Pooggin (2018) zwraca uwagę, że w wyżej wymienionych i podobnych przypadkach, rekombinowane genomy wirusowe potencjalnie obecne w mieszanej populacji quasi-gatunkowej viromu nie mogą być wiarygodnie zrekonstruowane na podstawie odczytów małego RNA.
Należy podkreślić, że istnieje kilka szlaków wyciszania komórkowego oprócz tych zaangażowanych w obronę (Brodersen i Voinnet, 2006; Zhang i Qu, 2016). Zhang i wsp. (2015) donieśli, że zarówno rośliny Arabidopsis typu dzikiego, jak i z defektem wyciszania RNA oraz N. benthamiana wykazywały podobny wzorzec losowej dominacji przez kilka wariantowych genotypów wirusa karbunkułu rzepy (TCV; Carmovirus, Tombusviridae). Odkrycie to może wskazywać, że pomimo zależności zarówno wyciszania RNA, jak i SIE od wysokiego podobieństwa sekwencji pomiędzy induktorem i wirusem prowokującym, istnieje inny mechanizm ochrony krzyżowej, odmienny od wyciszania RNA, który czeka na wyjaśnienie.