Colheita de linfócitos
Produção de anticorpos monoclonais requer a colheita das células produtoras de anticorpos encontradas no baço ou nos gânglios linfáticos.
Fusão para criar células híbridas
As células do baço têm tempos de sobrevivência limitados em cultura, requerem fusão com mielomas, células B cancerosas, para criar um híbrido imortalizado que pode passar por muitas passagens in vitro. Isto é conseguido através de polietilenoglicol (PEG) ou pulsos elétricos, ambos interrompendo a membrana celular e permitindo a fusão de duas células adjacentes.
Seleção para Híbridos Fusíveis
Fusão de células B e mieloma não é 100% eficiente. Portanto, a selecção para híbridos de mieloma múltiplo é necessária. O meio hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) inibe a síntese de DNA via aminopterina. As células B e os híbridos fundidos podem superar o cultivo no meio HAT, pois possuem timidina quinase que lhes permite sintetizar os precursores de DNA polimerase necessários do meio HAT fornecido com timidina. Os mielomas não produzem timidina quinase, e consequentemente não sobrevivem em meio HAT. Embora as células B mortais contenham timidina quinase, elas eventualmente morrem devido à limitada capacidade de replicação in vitro.
Atingir a Clonalidade com Diluições Limitantes
A população de células que sobrevivem à seleção ainda é heterogênea, contendo tanto múltiplos clones específicos para o antígeno alvo quanto clones que produzem anticorpos com especificidade irrelevante. Células únicas são necessárias para assegurar a clonalidade e alcançadas através de diluições limitantes. A diluição limitadora é uma técnica que dilui as concentrações de placas da população heterogênea de tal forma que, estatisticamente, cada poço conterá uma célula. Na prática, alguns poços podem não conter células, alguns não conterão uma única célula e outros conterão múltiplas células. No entanto, a repetição deste processo após as rondas de expansão irá assegurar que cada poço contenha apenas a expansão de uma única célula, e portanto resulta na produção de anticorpos monoclonais idênticos. Cada clone potencial deve ser minimamente testado através de uma triagem sobrenadante em um ELISA contra o antígeno. O sobrenadante de clones também pode ser rastreado para aplicações específicas antes de passar para o próximo estágio.
Expansão, Criopreservação, Produção e Purificação
Após atingir o status monoclonal e o desempenho bem sucedido nos ensaios de rastreamento, os hibridomas selecionados são expandidos e congelados em estoques redundantes para salvaguarda e preservação. O retorno a esses estoques de anticorpos monoclonais permite a consistência entre lotes e o desempenho confiável dos anticorpos. Os hibridomas para produção de anticorpos podem ser expandidos in vivo através de injecção no peritoneu de um hospedeiro. Esta técnica simples conhecida como produção de ascite caiu fora do favor, pois pode ser extremamente desconfortável para o animal hospedeiro. Alternativamente, técnicas in vitro de larga escala, como a produção de garrafas de rolo, permitem a produção à escala de litros, superando de longe as técnicas de ascite. Finalmente, a purificação simples para capturar imunoglobulina através da proteína A/G é tudo o que é necessário para recuperar anticorpos puros, já que todas as outras imunoglobulinas indesejadas foram removidas nos estágios de diluição e triagem limitantes.