30.4.2 De ce excludere?
Au fost propuse diverse mecanisme care stau la baza SIE (Zhou și Zhou, 2012). Trei ipoteze merită o atenție mai atentă. (1) Virusul secundar intră într-o celulă care este deja ocupată de virusul primar. Aici, sunt posibile următoarele evenimente: (a) CP supraexprimată a virusului primar împiedică dezasamblarea virusului secundar (Beachy și colab., 1990; Lu și colab, 1998); (b) ARN-ul neacoperit și, prin urmare, neprotejat al virusului secundar este degradat de complexul de reducere la tăcere indusă de ARN (RISC) al virusului primar; (c) ARN-ul cu catenă negativă al virusului primar se hibridizează cu ARN-ul virusului secundar, urmat de supunerea hibrizilor de ARN bicatenar (ARNdb) la scindarea mediată de Dicer, ceea ce duce la generarea de ARNsi (Fig. 30.4). (2) Virusul secundar intră în celule amorsate anterior cu siARN, dar care nu conțin ARN al virusului primar. În acest caz, RISC țintește ARN-ul virusului secundar, determinând degradarea acestuia. (3) Virusul secundar intră în celule aflate la distanță de celulele infectate. Aici, un semnal de la distanță este trimis pentru a amplifica răspunsul de reducere la tăcere de către ARN-polimeraza ARN dependentă de ARN endogenă (RdRp), care este capabilă să activeze RISC și să degradeze ARN-ul noului intrus.
Ipoteza despre SIE mediată de CP s-a bazat puternic pe constatarea că virusul transgenic N. tabacum și N. benthamiana care exprimă CP a TMV au prezentat rezistență la infecția cu acest virus, ceea ce sugerează că CP interferează cu decopertarea particulelor TMV în interiorul celulei (Beachy et al, 1990; Lu et al., 1998). Cu toate acestea, responsabilitatea exclusivă a acestui mecanism pentru SIE este discutabilă, mai ales pentru că s-a demonstrat că SIE este conferită cu succes de variante virale și viroizi cu CP defectuoasă (Gal-On și Shiboleth, 2006). SIE independent de CP între variantele deconstruite de TMV poate funcționa în N. benthamiana ca un mecanism de inducție timpurie și de răspândire rapidă (Julve et al., 2013). Într-o variantă deconstruită, funcțiile nedorite ale genomului sunt eliminate, iar virusul este reasamblat fie prin transferul funcțiilor lipsă către gazdă, fie prin înlocuirea acestora cu funcții analoge care nu provin de la un virus. Plantele de grâu infectate cu TriMV care exprimă WSMV NIa-Pro sau CP au fost protejate în mod substanțial de suprainfecția cu WSMV marcat cu proteină verde fluorescentă (WSMV-GFP), sugerând că ambii cistroni sunt efectori SIE codificați de WSMV (Tatineni și French, 2016). Mai mult, mutageneza de deleție a arătat că elicitarea SIE de către NIa-Pro necesită întreaga proteină, în timp ce CP are nevoie doar de un fragment mijlociu de 200 de aminoacizi din proteina de 349 de aminoacizi. În mod interesant, experimentele reciproce cu expresia mediată de WSMV a proteinelor TriMV au arătat că, într-un mod similar, atât TriMV CP, cât și TriMV NIa-Pro au exclus suprainfecția cu TriMV-GFP. Se poate concluziona că proteinele CP și NIa-Pro codificate de WSMV și TriMV sunt capabile să declanșeze rezistența la suprainfecție și că aceste două proteine declanșează SIE independent una de cealaltă (Tatineni și French, 2016).
Silențarea sistemică, care joacă un rol substanțial în cea de-a treia ipoteză, poate ajuta la înțelegerea fenomenelor de „recuperare” și „insule verzi”, observate în unele infecții naturale și în plantele transgenice care exprimă transgene derivate din virusuri. Fenomenul de recuperare, care se caracterizează printr-un răspuns inițial sever al plantelor la infecția virală, urmat de o reducere atât a severității simptomelor, cât și a nivelului de ARN în frunzele superioare tinere, este cunoscut ca fiind întâlnit la multe specii de plante (Nie și Molen, 2015). La plantele de tutun infectate cu PVY, îndepărtarea primelor trei frunze de deasupra frunzelor inoculate a interferat cu apariția recuperării, ceea ce ar putea indica faptul că semnalul care mediază recuperarea este generat în aceste frunze. În mod interesant și neașteptat, nivelul redus de ARN al PVY în frunzele superioare a fost observat, de asemenea, la tomate, dar nu și la plantele de cartof.
Așa cum au subliniat Ziebell și Carr (2010), ipoteza care implică reducerea la tăcere a ARN ar oferi o explicație plauzibilă a motivului pentru care SIE apare numai între tulpini/izolații de virus strâns înrudite și are nevoie de un interval de timp între inoculări. Un model mecanicist mai recent postulat de Zhang et al. (2018) pentru virusurile cu ARN presupune că SIE manifestă o funcție virală care împiedică genomurile progeniturilor să se re-replice în celulele părinților lor și vizează colateral viruși superinfectanți foarte omologi care nu se disting de virușii progeniturilor. Se propune, de asemenea, că SIE poate fi selectată din punct de vedere evolutiv pentru a menține o frecvență optimă a erorilor în genomurile progeniturilor.
În ultimii ani, au fost efectuate o serie de studii demne de remarcat în care secvențierea profundă și analiza bioinformatică a populației de ARN mic (sRNA-omics) au fost utilizate nu numai pentru diagnosticarea virusurilor ARN și ADN și reconstrucția genomurilor acestora, ci și pentru a reconstrui viromurile în infecțiile mixte (recenzate în Pooggin, 2018). Abordarea sRNA-omică utilizează un sistem de apărare antivirală bazat pe ARNi care implică generarea de siARN-uri. Într-un experiment de protecție încrucișată cu roșiile, o tulpină blândă CH2 a virusului mozaicului pepino (PepMV; Potexvirus, Alphaflexiviridae) a fost testată pentru protecție împotriva tulpinii LP a aceluiași virus (Turco et al., 2018). Inoculările reciproce au dus la o dublă infecție a tuturor plantelor individuale cu tulpinile CH2 și LP, reconstruite ca contig-uri separate de ARNsm. Invazia plantelor preinfectate cu CH2 de către tulpina LP, și invers, a fost însoțită de modificări ale secvențelor consensuale ale genomului în cvasi-specii virale. Aceste constatări pot indica faptul că utilizarea protecției încrucișate ca modalitate de a controla bolile virale ale plantelor poate fi grevată de un risc ridicat.
Un punct slab al abordării sRNA-omice este incapacitatea sa de a reconstrui complet secvențele genomice a două sau mai multe tulpini virale sau variante genetice care prezintă o mare identitate de secvență. Un studiu de caz realizat de Turco et al. (2018) pe o plantă de cartof infectată în mod natural a evidențiat un viromă care cuprinde tulpinile NTN și O de PVY, ale căror sARN-uri s-au asamblat în contig-uri chimerice, care au putut fi dezasamblate prin comparare cu secvențele genomului de referință. Două tulpini c-oinfectante au putut fi asamblate de novo doar în contig-uri de ARNsm specifice tulpinii pentru o porțiune de 1 kb 5′ a genomurilor virale, care au o identitate nucleotidică de 75 %. Restul părților rămase ale genomurilor, care împărtășesc o identitate de peste 87%, au fuzionat într-un singur contig de ARN mic chimeric și au putut fi separate doar printr-un ansamblu de genom de referință. Pooggin (2018) subliniază faptul că, în cazurile menționate mai sus și în cazuri similare, genomurile virale recombinante potențial prezente în populația cvasi-specie de virome mixte nu pot fi reconstruite în mod fiabil din lecturi de ARN mic.
Ar trebui subliniat faptul că există mai multe căi de silențiere celulară în plus față de cele implicate în apărare (Brodersen și Voinnet, 2006; Zhang și Qu, 2016). Zhang et al. (2015) au raportat că atât plantele de tip sălbatic, cât și plantele de Arabidopsis și N. benthamiana cu silențiere ARN defectuoasă au prezentat un model similar de dominanță aleatorie de către mai multe genotipuri variante ale virusului turnip crinkle (TCV; Carmovirus, Tombusviridae). Această constatare poate indica faptul că, în ciuda dependenței atât a reducerii la tăcere a ARN, cât și a SIE de o mare similitudine de secvență între virusul inductor și virusul de provocare, există un alt mecanism care stă la baza protecției încrucișate, diferit de reducerea la tăcere a ARN, care așteaptă să fie elucidat.
.