30.4.2 Warum Ausschluss?
Viele verschiedene Mechanismen, die SIE zugrunde liegen, wurden vorgeschlagen (Zhou und Zhou, 2012). Drei Hypothesen verdienen eine nähere Betrachtung. (1) Das Sekundärvirus dringt in eine Zelle ein, die bereits vom Primärvirus besetzt ist. Hier sind die folgenden Ereignisse möglich: (a) eine überexprimierte CP des Primärvirus verhindert den Abbau des Sekundärvirus (Beachy et al., 1990; Lu et al., 1998); (b) die nicht umhüllte und damit ungeschützte RNA des sekundären Virus wird durch den RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) des primären Virus abgebaut; (c) die negativsträngige RNA des primären Virus hybridisiert mit der RNA des sekundären Virus, woraufhin die doppelsträngigen RNA-Hybride (dsRNA) einer Dicer-vermittelten Spaltung unterzogen werden, was zur Bildung von siRNAs führt (Abb. 30.4). (2) Das sekundäre Virus dringt in Zellen ein, die zuvor mit siRNA grundiert wurden, aber keine RNA des primären Virus enthalten. In diesem Fall zielt RISC auf die RNA des sekundären Virus ab und verursacht dessen Abbau. (3) Das Sekundärvirus dringt in Zellen ein, die weit von den infizierten Zellen entfernt sind. Hier wird ein Fernsignal gesendet, um die Silencing-Antwort durch die endogene RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp) zu verstärken, die in der Lage ist, RISC zu aktivieren und die RNA des neuen Eindringlings abzubauen.
Die Hypothese über CP-vermittelte SIE stützte sich stark auf die Erkenntnis, dass transgene N. tabacum- und N. benthamiana-Pflanzen, die die CP von TMV exprimieren, eine Resistenz gegen eine Infektion mit diesem Virus zeigten, was darauf hindeutet, dass die CP die Entschichtung von TMV-Partikeln in der Zelle beeinträchtigt (Beachy et al., 1990; Lu et al., 1998). Es ist jedoch umstritten, ob dieser Mechanismus allein für die SIE verantwortlich ist, vor allem weil nachgewiesen wurde, dass SIE erfolgreich durch CP-defiziente virale Varianten und Viroide übertragen wird (Gal-On und Shiboleth, 2006). Die CP-unabhängige SIE zwischen dekonstruierten TMV-Varianten kann in N. benthamiana als ein früh induzierter und sich schnell ausbreitender Mechanismus wirken (Julve et al., 2013). Bei einer dekonstruierten Variante werden unerwünschte Genomfunktionen entfernt und das Virus wird neu zusammengesetzt, indem die fehlenden Funktionen entweder auf den Wirt übertragen oder durch analoge Funktionen ersetzt werden, die nicht von einem Virus stammen. Weizenpflanzen, die mit TriMV infiziert waren und WSMV NIa-Pro oder CP exprimierten, waren im Wesentlichen vor einer Superinfektion mit grün fluoreszierendem Protein-tagged WSMV (WSMV-GFP) geschützt, was darauf hindeutet, dass diese beiden Cistrone SIE-Effektoren sind, die von WSMV kodiert werden (Tatineni und French, 2016). Darüber hinaus ergab die Deletionsmutagenese, dass die Auslösung von SIE durch NIa-Pro das gesamte Protein erfordert, während CP nur ein mittleres 200-Aminosäure-Fragment des 349-Aminosäuren-Proteins benötigt. Interessanterweise zeigten wechselseitige Experimente mit WSMV-vermittelter Expression von TriMV-Proteinen, dass sowohl TriMV-CP als auch TriMV-NIa-Pro auf ähnliche Weise eine Superinfektion durch TriMV-GFP ausschlossen. Daraus lässt sich schließen, dass die von WSMV und TriMV kodierten CP- und NIa-Pro-Proteine in der Lage sind, eine Resistenz gegen Superinfektion auszulösen, und dass diese beiden Proteine unabhängig voneinander SIE auslösen (Tatineni und French, 2016).
Systemic Silencing, das eine wesentliche Rolle bei der dritten Hypothese spielt, kann helfen, die Phänomene der „Erholung“ und der „grünen Inseln“ zu verstehen, die bei einigen natürlichen Infektionen und bei transgenen Pflanzen, die von Viren abgeleitete Transgene exprimieren, beobachtet werden. Das Genesungsphänomen, das durch eine anfängliche schwere Reaktion der Pflanzen auf die Virusinfektion gekennzeichnet ist, gefolgt von einer Verringerung sowohl der Schwere der Symptome als auch der RNA-Konzentration in den jungen oberen Blättern, tritt bekanntermaßen bei vielen Pflanzenarten auf (Nie und Molen, 2015). Bei PVY-infizierten Tabakpflanzen beeinträchtigte die Entfernung der ersten drei Blätter über den inokulierten Blättern das Auftreten der Erholung, was darauf hindeuten könnte, dass das Signal, das die Erholung vermittelt, in diesen Blättern erzeugt wird. Interessanterweise und unerwartet wurde die verringerte PVY-RNA-Konzentration in den oberen Blättern auch bei Tomaten-, nicht aber bei Kartoffelpflanzen beobachtet.
Wie Ziebell und Carr (2010) betonten, würde die Hypothese des RNA-Silencing eine plausible Erklärung dafür liefern, warum SIE nur zwischen eng verwandten Virusstämmen/Isolaten auftritt und ein Zeitintervall zwischen den Inokulationen benötigt. Ein neueres mechanistisches Modell, das von Zhang et al. (2018) für RNA-Viren postuliert wurde, geht davon aus, dass SIE eine virale Funktion manifestiert, die verhindert, dass sich Nachkommengenome in den Zellen ihrer Eltern erneut vermehren, und dass sie kollateral auf hoch homologe superinfizierende Viren abzielt, die von Nachkommenviren nicht zu unterscheiden sind. Es wird ferner vorgeschlagen, dass SIE evolutionär selektiert sein könnte, um eine optimale Fehlerhäufigkeit in den Genomen der Nachkommen aufrechtzuerhalten.
In den letzten Jahren wurden eine Reihe bemerkenswerter Studien durchgeführt, in denen die Tiefensequenzierung und bioinformatische Analyse kleiner RNA-Populationen (sRNA-omics) nicht nur zur Diagnose von RNA- und DNA-Viren und zur Rekonstruktion ihrer Genome, sondern auch zur Rekonstruktion von Viromen bei Mischinfektionen eingesetzt wurden (Übersicht in Pooggin, 2018). Der sRNA-omics-Ansatz nutzt ein RNAi-basiertes antivirales Abwehrsystem, das die Erzeugung von siRNAs beinhaltet. In einem Kreuzschutz-Experiment mit Tomaten wurde ein milder Stamm CH2 des Pepino-Mosaik-Virus (PepMV; Potexvirus, Alphaflexiviridae) auf Schutz gegen den Stamm LP desselben Virus getestet (Turco et al., 2018). Wechselseitige Inokulationen führten zu einer dualen Infektion aller Einzelpflanzen mit den Stämmen CH2 und LP, die als separate sRNA-Contigs rekonstruiert wurden. Die Invasion von CH2-präinfizierten Pflanzen durch den Stamm LP und umgekehrt wurde von Veränderungen der Konsensgenomsequenzen in viralen Quasi-Spezies begleitet. Diese Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass der Einsatz von Kreuzschutz als Mittel zur Bekämpfung von Pflanzenviruskrankheiten mit einem hohen Risiko behaftet sein kann.
Eine Schwachstelle des sRNA-omics-Ansatzes ist seine Unfähigkeit, Genomsequenzen von zwei oder mehr Virusstämmen oder genetischen Varianten mit hoher Sequenzidentität vollständig zu rekonstruieren. Eine von Turco et al. (2018) an einer natürlich infizierten Kartoffelpflanze durchgeführte Fallstudie ergab ein Virom, das NTN- und O-Stämme von PVY umfasste, deren sRNAs sich zu chimären Contigs zusammenfügten, die durch Vergleich mit den Referenzgenomsequenzen entschlüsselt werden konnten. Zwei c-infizierende Stämme konnten nur für einen 1-kb-5′-Abschnitt der viralen Genome, die 75 % Nukleotididentität aufweisen, de novo zu stammspezifischen sRNA-Contigs assembliert werden. Die restlichen Teile der Genome, die mehr als 87 % Identität aufweisen, fusionierten zu einem chimären kleinen RNA-Contig und konnten nur durch eine referenzbasierte Genomassemblierung getrennt werden. Pooggin (2018) weist darauf hin, dass in den oben genannten und ähnlichen Fällen rekombinante virale Genome, die potenziell in der gemischten Virom-Quasi-Spezies-Population vorhanden sind, nicht zuverlässig aus kleinen RNA-Reads rekonstruiert werden können.
Es sollte betont werden, dass es neben den an der Verteidigung beteiligten zellulären Silencing-Signalwegen mehrere gibt (Brodersen und Voinnet, 2006; Zhang und Qu, 2016). Zhang et al. (2015) berichteten, dass sowohl Wildtyp- als auch RNA-Silencing-defiziente Arabidopsis- und N. benthamiana-Pflanzen ein ähnliches Muster zufälliger Dominanz durch verschiedene Genotypen des Turnip Crinkle Virus (TCV; Carmovirus, Tombusviridae) aufwiesen. Dieses Ergebnis könnte darauf hindeuten, dass trotz der Abhängigkeit von RNA-Silencing und SIE von einer hohen Sequenzähnlichkeit zwischen dem Induktor und dem Challenge-Virus ein anderer Mechanismus hinter dem Kreuzschutz steckt, der sich vom RNA-Silencing unterscheidet und noch geklärt werden muss.