Mission San Luis Obispo de Tolosa ligger i centrala Kalifornien och är uppkallad efter Saint Louis, biskop av Toulouse, och grundades den 1 september 1772 av fader Junipero Serra. Uppdraget grundades tre år efter att fäderna först upptäckte La Cañada de Los Osos – björnarnas dal – under en misslyckad resa från San Diego i jakt på Monterey.
När förråden minskade 1772 vid de redan etablerade fyra missionerna i Kalifornien plågades invånarna av livsmedelsbrist. Med bärens dal i åtanke skickades en jaktexpedition ut sommaren 1772 för att hämta hem kött. De lokala indianerna var tacksamma mot soldaterna för att de dödade björnarna, en fruktad fiende. En del av köttet byttes med lokalbefolkningen i utbyte mot ätbara frön, varefter fader Serra beslutade att La Cañada de Los Osos skulle vara en idealisk plats för det femte uppdraget. Även om staden San Luis Obispo inte har förblivit ett ruggigt björnland, sitter en staty av en grizzlybjörn som en påminnelse på missionens torg.
År 1776, fyra år efter grundandet, avfyrade en indian en flammande pil på taket till en av missionens byggnader, vilket startade en katastrofal eldsvåda som allvarligt skadade flera byggnader. Efter denna incident började fäderna arbeta med att tillverka takpannor lokalt för att minska känsligheten för brand.
I takt med att staden moderniserades gjorde även missionen det. Det som en gång var fädernas soppkök är nu detta ungdomscenter. Mission San Luis Obispo är ett av de enda uppdrag som aldrig behövde flytta; det står fortfarande på sin ursprungliga plats.
Missionens väggar, som är 50 till 60 fot höga, byggdes i enlighet med Vatikanens lag. Enligt denna lag skulle kyrkor byggas lika höga som det lokala trädet – i det här fallet en tall. Kyrkan, med ett långt sekundärt skepp, bildar en L-formad kyrka, den enda i sitt slag bland Kaliforniens missioner.
Fadern Luis Antonio Martinez, som ledde uppdraget i 34 år, odlade en stor uppdragsvingård. Han sålde en del av detta vin till de andra missionerna när de inte kunde odla sitt eget, och exporterade det även så långt som till England och Ryssland.