Die Chromatographie ist, wie oben erwähnt, ein Trennverfahren mit zwei Phasen, einer stationären und einer mobilen. Bei der stationären Phase handelt es sich in der Regel um einen porösen Feststoff (z. B. Glas, Siliziumdioxid oder Aluminiumoxid), der in ein Glas- oder Metallrohr gepackt ist oder die Wände einer Kapillare mit offenen Rohren bildet. Die mobile Phase fließt durch das gepackte Bett oder die Säule. Die zu trennende Probe wird am Anfang der Säule eingespritzt und von der mobilen Phase durch das System transportiert. Auf ihrem Weg durch die Säule verteilen sich die verschiedenen Substanzen entsprechend ihrer relativen Affinität zu den beiden Phasen. Die Geschwindigkeit des Durchlaufs hängt von den Werten der Verteilungskoeffizienten ab, wobei die Komponenten, die stärker mit der stationären Phase interagieren, längere Zeiträume für die Elution (vollständige Entfernung von der Säule) benötigen. Die Trennung beruht also auf Unterschieden im Verteilungsverhalten, die sich in unterschiedlichen Wanderungszeiten durch die Säule niederschlagen. Wie bei der repetitiven Extraktion gilt: Je größer der Trennfaktor für ein Komponentenpaar ist, desto kürzer ist die Säule, die für die Trennung erforderlich ist. Die Chromatographie ist also analog zur mehrstufigen Extraktion, nur dass es bei der Chromatographie keine diskontinuierlichen Schritte gibt, sondern einen kontinuierlichen Fluss. Die Chromatographie ist heute die bedeutendste Methode zur Trennung organischer Substanzen und wird neben der Elektrophorese am häufigsten für biologische Substanzen eingesetzt.
Die verschiedenen chromatographischen Methoden werden nach der mobilen Phase charakterisiert: gasförmig: Gaschromatographie (GC); flüssig: Flüssigkeitschromatographie (LC); überkritische Flüssigkeit: überkritische Flüssigkeitschromatographie (SFC). Die Methoden werden dann weiter nach der stationären Phase unterteilt; wenn die stationäre Phase ein festes Adsorptionsmittel ist, gibt es Methoden wie die Gas-Feststoff-Chromatographie (GSC) und die Flüssig-Fest-Chromatographie (LSC). Die Chromatographie wird mit computergesteuerten Instrumenten durchgeführt, die eine hohe Präzision und einen unbeaufsichtigten Betrieb ermöglichen. Darüber hinaus wird häufig ein Detektor nach der Säule für die Strukturanalyse oder die Quantifizierung oder beides eingesetzt. Eine der leistungsfähigsten Analysemethoden, die heute zur Verfügung stehen, ist die Online-Kopplung der Chromatographie mit der Massenspektrometrie.
Die Gaschromatographie ist aufgrund ihrer Geschwindigkeit, ihres Auflösungsvermögens und ihrer Detektorempfindlichkeit eine wichtige Methode. Da sie auf Verdampfung beruht, eignet sich diese Technik am besten für Verbindungen, die verdampft werden können, ohne sich zu zersetzen. Viele Substanzen, die normalerweise nicht leicht verdampfen, können chemisch derivatisiert werden, um eine erfolgreiche Verflüchtigungstrennung durch Gaschromatographie zu ermöglichen.
Neben der Chromatographie wird auch die Gas-Feststoff-Verteilung häufig zur Reinigung eingesetzt, wobei spezielle Adsorptionsmittel, so genannte Molekularsiebe, verwendet werden. Diese Materialien enthalten Poren, die ungefähr die gleichen Abmessungen haben wie kleine Moleküle. Diese Eigenschaft kann bei der Trennung von Molekülen mit linearen Strukturen von solchen mit sperrigen Strukturen ausgenutzt werden. Erstere können ohne weiteres in die Poren eindringen, letztere hingegen nicht. Dies ist ein Beispiel für einen Ausschlussmechanismus der Trennung (aufgrund von Formunterschieden). Molekularsiebe spielen auch eine wichtige Rolle bei der Trocknung von Gasen: Wasser, eine polare Substanz (d. h. ihre positiven und negativen elektrischen Ladungen sind innerhalb des Moleküls ungleichmäßig verteilt), wird leicht an den Partikeln adsorbiert, aber weniger polare Gase werden nicht zurückgehalten.
Bei der Sublimation, einer anderen Methode der Gas-Feststoff-Verteilung, verdampft ein Feststoff, ohne den flüssigen Zustand zu durchlaufen. Da nicht alle Stoffe sublimieren, ist die Anwendbarkeit der Methode begrenzt.
Seit Anfang der 1970er Jahre hat sich die Flüssigchromatographie zur wichtigsten Trennmethode für organische Stoffe entwickelt. Da es sich bei der mobilen Phase um eine Flüssigkeit handelt, entfällt das Erfordernis der Verdampfung, und daher kann die LC ein viel breiteres Spektrum von Substanzen trennen als die GC. Zu den Arten, die erfolgreich getrennt wurden, gehören anorganische Ionen, Aminosäuren, Medikamente, Zucker, Oligonukleotide und Proteine. Es wurden sowohl Flüssigchromatografien im analytischen Maßstab mit Proben im Mikrogramm- bis Milligrammbereich als auch präparative Flüssigchromatografien im Zehn-Gramm-Bereich entwickelt. In der Biotechnologie ist die präparative Flüssigchromatographie besonders wichtig für die Reinigung von Proteinen und Peptidhormonen, die durch rekombinante Technologie hergestellt werden.
Eine wichtige Methode ist die Flüssig-Fest-Chromatographie, bei der das poröse Adsorptionsmittel polar ist und die Trennung auf den Eigenschaften von Verbindungsklassen beruht, z.B. Amine (alkalisch) von Alkoholen (neutral) und Ester (neutral) von Säuren.
Die Flüssig-Fest-Chromatographie ist die älteste der chromatographischen Methoden. Bis Mitte des 20. Jahrhunderts hatte sich das experimentelle Verfahren gegenüber seiner ursprünglichen Form nicht wesentlich verändert. Nach erheblichen Verbesserungen wird die Flüssig-Fest-Chromatographie heute mit porösen Partikeln mit einem Durchmesser von nur 3 bis 5 Mikrometern (0,00012 bis 0,00020 Zoll) durchgeführt, wobei Flüssigkeitspumpen verwendet werden, um die Flüssigkeit durch die mit Partikeln gefüllte Säule zu treiben. Es werden hohe Auflösungen und schnelle Trennungen erzielt, da die kleinen Partikel eine gute Effizienz bei schnellen Geschwindigkeiten der mobilen Phase (ein Zentimeter pro Sekunde oder mehr) ermöglichen. Diese Technik ist auch für die Aufreinigung wichtig, und die abgetrennten Substanzen können nach der Säule automatisch mit einem Fraktionssammler aufgefangen werden.
Ein wichtiges Verfahren der Flüssig-Fest-Chromatographie ist die Umkehrphasen-Chromatographie, bei der die flüssige mobile Phase Wasser in Kombination mit einem organischen Lösungsmittel wie Methanol oder Acetonitril ist und die Oberfläche der stationären Phase unpolar oder kohlenwasserstoffähnlich ist. Im Gegensatz zur Normalphasenchromatographie, bei der die Oberfläche des Adsorptionsmittels polar ist, erfolgt bei der Umkehrphasenchromatographie die Elution der Substanzen von der Säule in der Reihenfolge der zunehmenden Polarität. Darüber hinaus basiert die Trennung auf den unpolaren Aspekten der Substanzen. Bei der Trennung einer Reihe von Peptiden aus menschlichem Wachstumshormon, einem rekombinant hergestellten Arzneimittel, wird ein Enzym, Trypsin, verwendet, um Peptidbindungen zu brechen, die die basischen Aminosäuren – Arganin und Lysin – enthalten, um einen spezifischen Fingerabdruck des Proteins zu erhalten. Die Peptidkartierung ist eine wichtige Methode zur Bewertung der Reinheit komplexer Substanzen wie Proteine.
Die Ionenaustauschchromatographie (IEC) ist ein Teilbereich der Flüssig-Fest-Chromatographie, verdient aber aufgrund ihrer Bedeutung eine besondere Erwähnung. Wie der Name schon sagt, trennt das Verfahren Ionen; Grundlage der Trennung ist die unterschiedliche Anziehung verschiedener Ionen in einer Lösung zu entgegengesetzt geladenen Stellen auf einer fein verteilten, unlöslichen Substanz (dem Ionenaustauscher, in der Regel ein Kunstharz). Bei einem Kationenaustauscherharz sind alle Stellen negativ geladen, so dass nur positive Ionen getrennt werden können; ein Anionenaustauscherharz hat positiv geladene Stellen. Die Ionenaustauschchromatographie ist zu einer der wichtigsten Methoden für die Trennung von Proteinen und kleinen Oligonukleotiden geworden.
Eine wichtige Anwendung des Ionenaustauschs ist die Entfernung von gelösten Eisen-, Kalzium- und Magnesiumionen aus hartem Wasser. Die negativen Stellen auf einem Kationenaustauscher werden zunächst mit Natriumionen neutralisiert, indem sie einer starken Kochsalzlösung (Natriumchlorid) ausgesetzt werden; wenn das harte Wasser durch das Harz geleitet wird, werden die unerwünschten Ionen im Wasser durch Natriumionen ersetzt.
Die Flüssig-Fest-Adsorptionschromatographie kann auch auf dünnen, flachen Platten durchgeführt werden (Dünnschichtchromatographie oder TLC). Die TLC ist kostengünstig und schnell, aber nicht so empfindlich und effizient wie die Säulenchromatographie. In der Praxis wird das Adsorptionsmittel auf eine Glasplatte aufgetragen und getrocknet. Die Probe wird als Punkt in der Nähe eines Endes der Platte aufgetragen, die (vertikal) in ein flaches Reservoir mit der mobilen Phase gestellt wird. Während die mobile Phase durch Kapillarwirkung auf der Platte nach oben wandert, löst sich die Probe in der Flüssigkeit auf, und ihre Bestandteile werden auf der Platte zu neuen Positionen in unterschiedlichen Abständen vom Ausgangspunkt transportiert. (Für weitere Informationen siehe den Artikel Chromatographie)