In vivo ist Chymotrypsin ein proteolytisches Enzym (Serinprotease), das in den Verdauungssystemen vieler Organismen wirkt. Es ermöglicht die Spaltung von Peptidbindungen durch eine Hydrolysereaktion, die zwar thermodynamisch günstig ist, aber in Abwesenheit eines Katalysators extrem langsam abläuft. Die Hauptsubstrate von Chymotrypsin sind Peptidbindungen, bei denen die N-terminale Aminosäure der Bindung ein Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin oder Leucin ist. Wie viele Proteasen hydrolysiert auch Chymotrypsin in vitro Amidbindungen, eine Eigenschaft, die die Verwendung von Substratanaloga wie N-Acetyl-L-phenylalanin-p-Nitrophenylamid für Enzymtests ermöglichte.
Chymotrypsin spaltet Peptidbindungen, indem es die unreaktive Carbonylgruppe mit einem starken Nukleophil angreift, dem Serin 195-Rest im aktiven Zentrum des Enzyms, der kurzzeitig kovalent an das Substrat gebunden wird und ein Enzym-Substrat-Zwischenprodukt bildet. Zusammen mit Histidin 57 und Asparaginsäure 102 bildet dieser Serinrest die katalytische Triade des aktiven Zentrums.
Diese Erkenntnisse beruhen auf Hemmungsversuchen und der Untersuchung der Kinetik der Spaltung des genannten Substrats, wobei die Tatsache ausgenutzt wird, dass das Enzym-Substrat-Zwischenprodukt p-Nitrophenolat eine gelbe Farbe hat, die es ermöglicht, seine Konzentration durch Messung der Lichtabsorption bei 410 nm zu bestimmen.
Die Reaktion von Chymotrypsin mit seinem Substrat verläuft in zwei Phasen, einer anfänglichen „Burst“-Phase zu Beginn der Reaktion und einer Steady-State-Phase nach der Michaelis-Menten-Kinetik. Die Wirkungsweise von Chymotrypsin erklärt dies dadurch, dass die Hydrolyse in zwei Schritten abläuft. Zunächst erfolgt die Acylierung des Substrats, um ein Acyl-Enzym-Zwischenprodukt zu bilden, und dann die Deacylierung, um das Enzym in seinen ursprünglichen Zustand zurückzuführen. Dies geschieht durch die konzertierte Aktion der drei Aminosäurereste in der katalytischen Triade. Aspartat geht eine Wasserstoffbrückenbindung mit dem N-δ-Wasserstoff von Histidin ein, wodurch sich der pKa-Wert seines ε-Stickstoffs erhöht und es so in die Lage versetzt wird, Serin zu deprotonieren. Diese Deprotonierung ermöglicht es der Serin-Seitenkette, als Nukleophil zu wirken und an das elektronenarme Carbonylkohlenstoffatom der Hauptkette des Proteins zu binden. Die Ionisierung des Carbonylsauerstoffs wird durch die Bildung von zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu benachbarten N-Wasserstoffatomen der Hauptkette stabilisiert. Dies geschieht im Oxyanion-Loch. Dadurch wird ein tetraedrisches Addukt gebildet und die Peptidbindung gebrochen. Es entsteht ein Acyl-Enzym-Zwischenprodukt, das an das Serin gebunden ist, und der neu gebildete Aminoterminus des gespaltenen Proteins kann dissoziieren. Im zweiten Reaktionsschritt wird ein Wassermolekül durch das basische Histidin aktiviert und wirkt als Nukleophil. Der Sauerstoff des Wassers greift den Carbonylkohlenstoff der seringebundenen Acylgruppe an, was zur Bildung eines zweiten tetraedrischen Addukts, zur Regeneration der Serin -OH-Gruppe und zur Freisetzung eines Protons sowie des Proteinfragments mit dem neu gebildeten Carboxylterminus führt