30.4.2 Proč vyloučení?
Byly navrženy různé mechanismy, které stojí za SIE (Zhou a Zhou, 2012). Bližší pozornost si zaslouží tři hypotézy. (1) Sekundární virus vstupuje do buňky, která je již obsazena primárním virem. Zde jsou možné následující události: (a) nadměrná exprese CP primárního viru brání rozpadu sekundárního viru (Beachy et al., 1990; Lu et al., (b) nepokrytá, a tedy nechráněná RNA sekundárního viru je degradována komplexem RNA-indukovaného umlčování (RISC) primárního viru; (c) RNA primárního viru s negativním řetězcem hybridizuje s RNA sekundárního viru, načež jsou hybridy dvouřetězcové RNA (dsRNA) podrobeny štěpení zprostředkovanému Dicerem, což vede ke vzniku siRNA (obr. 30.4). (2) Sekundární virus vstupuje do buněk, které byly předtím připraveny siRNA, ale neobsahují RNA primárního viru. V tomto případě se RISC zaměří na RNA sekundárního viru a způsobí její degradaci. (3) Sekundární virus vstupuje do buněk vzdálených od infikovaných buněk. Zde je vyslán signál na velkou vzdálenost, který zesílí odpověď na umlčení endogenní RNA-dependentní RNA polymerázou (RdRp), která je schopna aktivovat RISC a degradovat RNA nového inkomeru.
Hypotéza o SIE zprostředkovaném CP se silně opírala o zjištění, že transgenní virus N. tabacum a N. benthamiana exprimující CP TMV vykazovaly odolnost vůči infekci tímto virem, což naznačuje, že CP zasahuje do rozbalování částic TMV uvnitř buňky (Beachy et al., 1990; Lu et al., 1998). Výlučná odpovědnost tohoto mechanismu za SIE je však sporná, především proto, že bylo prokázáno, že SIE úspěšně předávají CP-defektní varianty virů a viroidů (Gal-On a Shiboleth, 2006). CP-nezávislá SIE mezi dekonstruovanými variantami TMV může u N. benthamiana fungovat jako brzy indukovaný a rychle se šířící mechanismus (Julve et al., 2013). V dekonstruované variantě jsou odstraněny nežádoucí funkce genomu a virus je znovu sestaven buď přenosem chybějících funkcí do hostitele, nebo jejich nahrazením analogickými funkcemi, které nepocházejí z viru. Rostliny pšenice infikované TriMV exprimujícím WSMV NIa-Pro nebo CP byly podstatně chráněny před superinfekcí WSMV značeným zeleným fluorescenčním proteinem (WSMV-GFP), což naznačuje, že oba tyto cistrony jsou SIE efektory kódované WSMV (Tatineni a French, 2016). Kromě toho deleční mutageneze odhalila, že vyvolání SIE pomocí NIa-Pro vyžaduje celý protein, zatímco CP potřebuje pouze 200-aminokyselinový střední fragment 349-aminokyselinového proteinu. Zajímavé je, že reciproční experimenty s expresí proteinů TriMV zprostředkovanou WSMV ukázaly, že podobným způsobem jak TriMV CP, tak TriMV NIa-Pro vylučují superinfekci TriMV-GFP. Z toho lze vyvodit, že proteiny CP a NIa-Pro kódované WSMV a TriMV jsou schopny vyvolat odolnost vůči superinfekci a že tyto dva proteiny vyvolávají SIE nezávisle na sobě (Tatineni a French, 2016).
Systémové umlčování, které hraje podstatnou roli ve třetí hypotéze, může pomoci pochopit jevy „zotavení“ a „zelených ostrovů“, pozorované u některých přirozených infekcí a u transgenních rostlin exprimujících transgeny odvozené od viru. Fenomén zotavení, který je charakterizován počáteční silnou reakcí rostlin na virovou infekci následovanou snížením závažnosti symptomů i hladiny RNA v mladých horních listech, je znám u mnoha druhů rostlin (Nie a Molen, 2015). U rostlin tabáku infikovaných PVY bránilo odstranění prvních tří listů nad inokulovanými listy výskytu zotavení, což by mohlo naznačovat, že signál zprostředkující zotavení je generován v těchto listech. Zajímavé a nečekané je, že snížená hladina RNA PVY v horních listech byla pozorována také u rostlin rajčete, ale ne u rostlin bramboru.
Jak upozornili Ziebell a Carr (2010), hypotéza zahrnující umlčení RNA by poskytla pravděpodobné vysvětlení toho, proč se SIE vyskytuje pouze mezi blízce příbuznými kmeny/izoláty viru a potřebuje časový interval mezi inokulacemi. Novější mechanistický model postulovaný Zhangem et al. (2018) pro RNA viry předpokládá, že SIE se projevuje virovou funkcí, která brání genomům potomků v opětovném množení v buňkách jejich rodičů, a kolaterálně se zaměřuje na vysoce homologní superinfekční viry, které jsou nerozlišitelné od virů potomků. Dále se předpokládá, že SIE může být evolučně selektována za účelem udržení optimální frekvence chyb v genomech potomků.
V posledních letech byla provedena řada pozoruhodných pokusů, v nichž bylo hloubkové sekvenování a bioinformatická analýza populace malých RNA (sRNA-omika) využito nejen k diagnostice RNA a DNA virů a rekonstrukci jejich genomů, ale také k rekonstrukci viromů u smíšených infekcí (přehled v Pooggin, 2018). Přístup sRNA-omics využívá protivirový obranný systém založený na RNAi zahrnující generování siRNA. V pokusu s křížovou ochranou rajčat byl testován mírný kmen CH2 viru pepino mosaic (PepMV; Potexvirus, Alphaflexiviridae) na ochranu proti kmeni LP téhož viru (Turco et al., 2018). Reciproční inokulace vedly k duální infekci všech jednotlivých rostlin kmeny CH2 a LP, rekonstruovanými jako samostatné kontigy sRNA. Invaze rostlin předinfikovaných kmenem CH2 kmenem LP a naopak byla doprovázena změnami konsenzuálních sekvencí genomu virových kvazidruhů. Tato zjištění mohou naznačovat, že používání křížové ochrany jako způsobu kontroly virových onemocnění rostlin může být zatíženo vysokým rizikem.
Slabinou sRNA-omického přístupu je jeho neschopnost kompletně rekonstruovat sekvence genomu dvou, případně více virových kmenů nebo genetických variant vykazujících vysokou sekvenční identitu. Případová studie, kterou provedli Turco et al. (2018) na přirozeně infikované rostlině bramboru, odhalila virom zahrnující kmeny PVY NTN a O, jejichž sRNA se sestavily do chimérických kontigů, které bylo možné rozložit porovnáním s referenčními sekvencemi genomu. Dva kmeny c-infekce bylo možné sestavit de novo do kmenově specifických kontigů sRNA pouze pro 1-kb 5′ část virových genomů, které sdílejí 75 % nukleotidové identity. Zbývající části genomů, sdílející více než 87% identitu, se spojily do jednoho chimérického kontigu malé RNA a mohly být odděleny pouze sestavením genomu na základě referenčních genomů. Pooggin (2018) upozorňuje, že ve výše uvedených a podobných případech nelze rekombinantní virové genomy potenciálně přítomné ve smíšené kvazidruhové populaci virů spolehlivě rekonstruovat ze čtení malé RNA.
Je třeba zdůraznit, že kromě drah zapojených do obrany existuje několik drah buněčného umlčování (Brodersen a Voinnet, 2006; Zhang a Qu, 2016). Zhang et al. (2015) uvedli, že jak divoký typ, tak rostliny Arabidopsis a N. benthamiana s defektem umlčování RNA vykazovaly podobný vzorec náhodné dominance několika variantních genotypů viru krnění řepy (TCV; Carmovirus, Tombusviridae). Toto zjištění může naznačovat, že navzdory závislosti RNA silencingu i SIE na vysoké sekvenční podobnosti mezi induktorem a napadeným virem existuje další mechanismus křížové ochrany, odlišný od RNA silencingu, který čeká na objasnění.