30.4.2 Miért kizárás?
Változatos mechanizmusokat javasoltak a SIE hátterében (Zhou és Zhou, 2012). Három hipotézis érdemel közelebbi figyelmet. (1) A másodlagos vírus olyan sejtbe kerül, amelyet az elsődleges vírus már elfoglalt. Itt a következő események lehetségesek: (a) az elsődleges vírus túlexpresszált CP-je megakadályozza a másodlagos vírus szétesését (Beachy et al., 1990; Lu et al., 1998); b) a másodlagos vírus bevonat nélküli és ezáltal védtelen RNS-ét az elsődleges vírus RNS-indukált csendesítő komplexe (RISC) lebontja; c) az elsődleges vírus negatív szálú RNS-e hibridizálódik a másodlagos vírus RNS-ével, majd a kettős szálú RNS (dsRNS) hibrideket Dicer által közvetített hasításnak vetik alá, ami siRNS-ek keletkezését eredményezi (30.4. ábra). (2) A másodlagos vírus bejut a korábban siRNS-szel alapozott, de az elsődleges vírus RNS-ét nem tartalmazó sejtekbe. Ebben az esetben a RISC a másodlagos vírus RNS-ét veszi célba, és annak lebontását okozza. (3) A másodlagos vírus a fertőzött sejtektől távoli sejtekbe jut. Itt egy távolsági jelet küld a csendesítő válasz felerősítésére az endogén RNS-függő RNS-polimeráz (RdRp), amely képes aktiválni a RISC-t és lebontani az új bejövő RNS-ét.
A CP-mediált SIE-ről szóló hipotézis erősen támaszkodott arra a megállapításra, hogy a transzgenikus N. tabacum és N. benthamiana növények, amelyek a TMV CP-jét expresszálták, rezisztenciát mutattak e vírussal való fertőzéssel szemben, ami arra utal, hogy a CP beavatkozik a TMV-részecskéknek a sejt belsejében történő bevonatbontásába (Beachy et al., 1990; Lu et al., 1998). Ennek a mechanizmusnak a kizárólagos felelőssége a SIE-ért azonban vitatható, főként azért, mert a SIE-t CP-defektív vírusvariánsok és viroidok is sikeresen adták (Gal-On és Shiboleth, 2006). A CP-független SIE a TMV dekonstruktív változatai között N. benthamiana-ban korai indukált és gyorsan terjedő mechanizmusként működhet (Julve és mtsai., 2013). Egy dekonstruált variánsban a nemkívánatos genomfunkciókat eltávolítják, és a vírust újra összerakják úgy, hogy a hiányzó funkciókat vagy átadják a gazdaszervezetnek, vagy analóg, nem vírusból származó funkciókkal helyettesítik. A WSMV NIa-Pro-t vagy CP-t expresszáló TriMV-vel fertőzött búzanövények jelentősen védettek a zöld fluoreszcens fehérjével jelölt WSMV (WSMV-GFP) szuperinfekciójától, ami arra utal, hogy mindkét cisztron a WSMV által kódolt SIE effektorok (Tatineni és French, 2016). Továbbá a deléciós mutagenezis kimutatta, hogy a SIE kiváltása NIa-Pro által a teljes fehérjét igényli, míg a CP-nek csak a 349 aminosavból álló fehérje 200 aminosavas középső fragmentumára van szüksége. Érdekes módon a TriMV fehérjék WSMV-mediált expressziójával végzett reciprok kísérletek azt mutatták, hogy hasonló módon mind a TriMV CP, mind a TriMV NIa-Pro kizárta a TriMV-GFP általi szuperinfekciót. Megállapítható, hogy a WSMV- és TriMV-kódolt CP és NIa-Pro fehérjék képesek kiváltani a szuperinfekcióval szembeni rezisztenciát, és hogy ez a két fehérje egymástól függetlenül váltja ki a SIE-t (Tatineni és French, 2016).
A harmadik hipotézisben jelentős szerepet játszó szisztémás csendesedés segíthet megérteni a “helyreállás” és a “zöld szigetek” jelenségeit, amelyeket egyes természetes fertőzésekben és a vírus által létrehozott transzgéneket expresszáló transzgenikus növényekben figyelhetünk meg. A regenerálódás jelensége, amelyet a növények vírusfertőzésre adott kezdeti súlyos válasza jellemez, amelyet a tünetek súlyosságának és a fiatal felső levelek RNS-szintjének csökkenése követ, számos növényfajban ismert (Nie és Molen, 2015). PVY-fertőzött dohánynövényekben a beoltott levelek feletti első három levél eltávolítása megzavarta a gyógyulás bekövetkezését, ami arra utalhat, hogy a gyógyulást közvetítő jel ezekben a levelekben keletkezik. Érdekes és váratlan módon a PVY RNS csökkent szintje a felső levelekben paradicsomban is megfigyelhető volt, de burgonya növényekben nem.
Amint arra Ziebell és Carr (2010) rámutatott, az RNS csendesítéssel kapcsolatos hipotézis plauzibilis magyarázatot adna arra, hogy a SIE miért csak közeli rokon vírustörzsek/izolátumok között fordul elő, és miért van szükség az oltások közötti időintervallumra. Egy újabb mechanisztikus modell, amelyet Zhang és munkatársai (2018) posztuláltak az RNS-vírusokra, azt feltételezi, hogy a SIE olyan vírusfunkciót nyilvánít meg, amely megakadályozza, hogy az utódok genomjai újra reprodukálódjanak a szüleik sejtjeiben, és kollaterálisan a nagy homológ szuperinfekciós vírusokat veszi célba, amelyek megkülönböztethetetlenek az utódvírusoktól. Továbbá azt javasolják, hogy a SIE evolúciósan szelektálódhat az utódgenomokban az optimális hibafrekvencia fenntartása érdekében.”
Az elmúlt években számos figyelemre méltó kísérletet végeztek, amelyekben a kis RNS-populáció mélyszekvenálását és bioinformatikai elemzését (sRNS-omika) nemcsak az RNS- és DNS-vírusok diagnosztizálására és genomjaik rekonstruálására, hanem vegyes fertőzésekben a viromok rekonstruálására is felhasználták (áttekintve: Pooggin, 2018). Az sRNA-omikai megközelítés RNSi alapú vírusellenes védelmi rendszert használ, amely siRNS-ek előállítását foglalja magában. Egy paradicsommal végzett keresztavédelmi kísérletben a pepino mozaikvírus (PepMV; Potexvirus, Alphaflexiviridae) enyhe CH2 törzsét vizsgálták az ugyanezen vírus LP törzsével szembeni védelem szempontjából (Turco et al., 2018). A kölcsönös oltások eredményeképpen minden egyes növény kettős fertőzést kapott CH2 és LP törzsekkel, amelyeket különálló sRNS-kontigokként rekonstruáltunk. A CH2 előfertőzött növények LP törzs általi invázióját, és fordítva, a vírus kvázifajok konszenzusos genomszekvenciáinak megváltozása kísérte. Ezek az eredmények arra utalhatnak, hogy a keresztvédekezés, mint a növényi vírusbetegségek elleni védekezés egyik módja, nagy kockázattal járhat.
A sRNS-omikai megközelítés gyenge pontja, hogy nem képes két vagy több, nagy szekvenciaazonosságot mutató vírustörzs vagy genetikai változat genomszekvenciájának teljes rekonstrukciójára. A Turco és munkatársai (2018) által egy természetesen fertőzött burgonyanövényen végzett esettanulmány a PVY NTN és O törzseit tartalmazó viromot mutatott ki, amelynek sRNS-jei kiméra kontigokká álltak össze, amelyeket a referencia genomszekvenciákkal való összehasonlítással lehetett kibontani. Két c-fertőző törzset csak a vírusgenomok 1 kbyte-os 5′ szakaszán lehetett de novo törzs-specifikus sRNS-kontigokká összerakni, amelyek 75%-os nukleotidazonosságot mutatnak. A genomok fennmaradó, több mint 87%-os azonosságot mutató részei egyetlen kimérikus kis RNS-kontiggá fuzionáltak, és csak referencia-alapú genom-összeállítással voltak elkülöníthetőek. Pooggin (2018) rámutat, hogy a fent említett és hasonló esetekben a vegyes virom kvázi fajpopulációban potenciálisan jelen lévő rekombináns vírusgenomok nem rekonstruálhatók megbízhatóan kis RNS-olvasatokból.
Kiemelendő, hogy a védekezésben részt vevőkön kívül számos sejtes elnémítási útvonal létezik (Brodersen és Voinnet, 2006; Zhang és Qu, 2016). Zhang és munkatársai (2015) arról számoltak be, hogy mind a vad típusú, mind az RNS-csendesítés-defektív Arabidopsis és N. benthamiana növények hasonló mintázatot mutattak a répa ráncosodás vírus (TCV; Carmovirus, Tombusviridae) több variáns genotípusának véletlenszerű dominanciájára. Ez a megállapítás arra utalhat, hogy annak ellenére, hogy mind az RNS csendesítés, mind a SIE az induktor és a kihívó vírus közötti nagyfokú szekvencia-hasonlóságtól függ, a keresztvédelem mögött egy másik, az RNS csendesítéstől eltérő mechanizmus áll, amely még tisztázásra vár.