30.4.2 Perché l’esclusione?
Sono stati proposti diversi meccanismi alla base della SIE (Zhou e Zhou, 2012). Tre ipotesi meritano maggiore attenzione. (1) Il virus secondario entra in una cellula che è già occupata dal virus primario. Qui, sono possibili i seguenti eventi: (a) CP sovraespresso del virus primario impedisce il disassemblaggio del virus secondario (Beachy et al., 1990; Lu et al, 1998); (b) l’RNA non rivestito, e quindi non protetto, del virus secondario viene degradato dal complesso di silenziamento indotto dall’RNA (RISC) del virus primario; (c) l’RNA a filamento negativo del virus primario si ibrida all’RNA del virus secondario, seguito dalla sottoposizione degli ibridi di RNA a doppio filamento (dsRNA) alla scissione mediata da Dicer, che porta alla generazione di siRNA (Fig. 30.4). (2) Il virus secondario entra nelle cellule precedentemente innescate dal siRNA, ma non contiene l’RNA del virus primario. In questo caso, RISC prende di mira l’RNA del virus secondario, causandone la degradazione. (3) Il virus secondario entra in cellule lontane dalle cellule infettate. Qui, un segnale a lunga distanza viene inviato per amplificare la risposta di silenziamento da parte della RNA polimerasi RNA-dipendente endogena (RdRp), che è in grado di attivare RISC e degradare l’RNA del nuovo incomero.
L’ipotesi sulla SIE mediata da CP si basava fortemente sulla scoperta che i transgenici N. tabacum e N. benthamiana che esprimono la CP del TMV hanno mostrato resistenza all’infezione con questo virus, suggerendo che la CP interferisce con lo slegamento delle particelle di TMV all’interno della cellula (Beachy et al, 1990; Lu et al., 1998). Tuttavia, la responsabilità esclusiva di questo meccanismo per la SIE è discutibile, soprattutto perché è stato dimostrato che la SIE è conferita con successo da varianti virali e viroidi CP-defettivi (Gal-On e Shiboleth, 2006). La SIE indipendente da CP tra varianti decostruite di TMV può funzionare in N. benthamiana come un meccanismo di diffusione precoce indotto e veloce (Julve et al., 2013). In una variante decostruita, le funzioni indesiderate del genoma vengono rimosse e il virus viene riassemblato trasferendo le funzioni mancanti all’ospite o sostituendole con funzioni analoghe che non provengono da un virus. Le piante di grano infettate con TriMV che esprimono WSMV NIa-Pro o CP erano sostanzialmente protette dalla superinfezione da WSMV etichettato con proteina fluorescente verde (WSMV-GFP), suggerendo che entrambi questi cistroni sono effettori SIE codificati da WSMV (Tatineni e French, 2016). Inoltre, la mutagenesi per delezione ha rivelato che l’elicitazione della SIE da parte di NIa-Pro richiede l’intera proteina, mentre CP ha bisogno solo di un frammento centrale di 200 aminoacidi della proteina di 349 aminoacidi. È interessante notare che gli esperimenti reciproci con l’espressione WSMV-mediata delle proteine TriMV hanno mostrato che, in modo simile, sia TriMV CP che TriMV NIa-Pro hanno escluso la superinfezione da TriMV-GFP. Si può concludere che le proteine CP e NIa-Pro codificate da WSMV e TriMV sono in grado di innescare la resistenza alla superinfezione e che queste due proteine elicitano la SIE indipendentemente l’una dall’altra (Tatineni e French, 2016).
Il silenziamento sistemico, che gioca un ruolo sostanziale nella terza ipotesi, può aiutare a comprendere i fenomeni di “recupero” e “isole verdi”, osservati in alcune infezioni naturali e in piante transgeniche che esprimono transgeni derivati dal virus. Il fenomeno del recupero, che è caratterizzato da una risposta iniziale grave delle piante all’infezione virale seguita da una riduzione sia della gravità dei sintomi che del livello di RNA nelle giovani foglie superiori, è noto per verificarsi in molte specie di piante (Nie e Molen, 2015). Nelle piante di tabacco infettate da PVY, la rimozione delle prime tre foglie sopra le foglie inoculate ha interferito con il verificarsi del recupero, il che potrebbe indicare che il segnale che media il recupero è generato in queste foglie. Interessante e inaspettato, il livello ridotto di PVY RNA nelle foglie superiori è stato osservato anche nel pomodoro, ma non nelle piante di patata.
Come sottolineato da Ziebell e Carr (2010), l’ipotesi che coinvolge il silenziamento dell’RNA fornirebbe una spiegazione plausibile del perché la SIE si verifica solo tra ceppi/isolati di virus strettamente correlati e necessita di un intervallo di tempo tra le inoculazioni. Un modello meccanicistico più recente postulato da Zhang et al. (2018) per i virus a RNA presuppone che la SIE manifesti una funzione virale che impedisce ai genomi della progenie di replicarsi nelle cellule dei genitori, e si rivolge collateralmente a virus superinfettivi altamente omologhi che sono indistinguibili dai virus della progenie. Si propone inoltre che la SIE possa essere evolutivamente selezionata per mantenere una frequenza di errore ottimale nei genomi della progenie.
Negli ultimi anni, sono state condotte numerose prove degne di nota in cui il sequenziamento profondo e l’analisi bioinformatica della popolazione di piccoli RNA (sRNA-omics) sono stati utilizzati non solo per la diagnosi dei virus a RNA e DNA e la ricostruzione dei loro genomi, ma anche per ricostruire i viromi nelle infezioni miste (rivisto in Pooggin, 2018). L’approccio sRNA-omics utilizza un sistema di difesa antivirale basato su RNAi che coinvolge la generazione di siRNA. In un esperimento di protezione incrociata con i pomodori, un ceppo mite CH2 del virus del mosaico pepino (PepMV; Potexvirus, Alphaflexiviridae) è stato testato per la protezione contro il ceppo LP dello stesso virus (Turco et al., 2018). Le inoculazioni reciproche hanno portato a una doppia infezione di tutte le singole piante con i ceppi CH2 e LP, ricostruiti come contigs sRNA separati. L’invasione delle piante CH2-preinfettate dal ceppo LP, e viceversa, è stata accompagnata da alterazioni delle sequenze del genoma di consenso nelle quasi-specie virali. Questi risultati possono indicare che l’uso della protezione incrociata come un modo per controllare le malattie da virus delle piante può essere gravato da un alto rischio.
Un punto debole dell’approccio sRNA-omics è la sua incapacità di ricostruire completamente le sequenze del genoma di due, o più, ceppi virali o varianti genetiche che mostrano alta identità di sequenza. Un caso di studio condotto da Turco et al. (2018) su una pianta di patata infettata naturalmente ha rivelato un vioma comprendente ceppi NTN e O di PVY, i cui sRNA si sono assemblati in contigs chimerici, che potrebbero essere disembroilizzati confrontandoli con le sequenze del genoma di riferimento. Due ceppi c-infettanti potrebbero essere assemblati solo de novo in contig di sRNA specifici del ceppo per una porzione di 1 kb 5′ dei genomi virali, che condividono il 75% di identità nucleotidica. Le parti rimanenti dei genomi, che condividono più dell’87% di identità, si sono fuse in un unico contig di piccolo RNA chimerico e potrebbero essere separate solo da un assemblaggio del genoma basato sul riferimento. Pooggin (2018) sottolinea che nei casi sopra citati e simili, i genomi virali ricombinanti potenzialmente presenti nella popolazione mista di quasi-specie virome non possono essere ricostruiti in modo affidabile dalle letture di small RNA.
Si deve sottolineare che ci sono diverse vie di silenziamento cellulare oltre a quelle coinvolte nella difesa (Brodersen e Voinnet, 2006; Zhang e Qu, 2016). Zhang et al. (2015) hanno riferito che sia le piante di Arabidopsis e N. benthamiana wild-type e RNA silencing-defective hanno mostrato un modello simile di dominanza casuale da diversi genotipi varianti di rapa crinkle virus (TCV; Carmovirus, Tombusviridae). Questo risultato può indicare che, nonostante la dipendenza sia del silenziamento dell’RNA che del SIE dall’alta somiglianza di sequenza tra l’induttore e il virus di sfida, c’è un altro meccanismo dietro la protezione incrociata, distinto dal silenziamento dell’RNA, che attende di essere chiarito.