Chromatografie is, zoals hierboven vermeld, een scheidingsproces met twee fasen, een stationaire en een mobiele. Gewoonlijk is de stationaire fase een poreuze vaste stof (b.v. glas, silica of aluminiumoxide) die in een glazen of metalen buis is verpakt of die de wanden van een capillair met open buis vormt. De mobiele fase stroomt door het verpakte bed of de kolom. Het te scheiden monster wordt aan het begin van de kolom geïnjecteerd en wordt door de mobiele fase door het systeem getransporteerd. Tijdens hun reis door de kolom verdelen de verschillende stoffen zich naar gelang van hun relatieve affiniteit voor de twee fasen. De snelheid van het traject is afhankelijk van de waarden van de verdelingscoëfficiënten, aangezien de componenten die een sterkere wisselwerking met de stationaire fase hebben, een langere elutieperiode nodig hebben (volledige verwijdering uit de kolom). De scheiding is dus gebaseerd op verschillen in distributiegedrag die tot uiting komen in verschillende migratietijden door de kolom. Net als bij repetitieve extractie geldt ook hier dat hoe groter de scheidingsfactor voor een paar componenten is, hoe korter de kolom zal zijn die nodig is om deze componenten op te lossen. Chromatografie is dus analoog aan meerstapsextractie, behalve dat er bij chromatografie geen discontinue stappen zijn, maar een continue stroom. Momenteel is chromatografie de belangrijkste methode voor de scheiding van organische stoffen en wordt zij, samen met elektroforese, het meest gebruikt voor biologische stoffen.
De verschillende chromatografische methoden worden gekarakteriseerd aan de hand van de mobiele fase – gas: gaschromatografie (GC); vloeistof: vloeistofchromatografie (LC); superkritische vloeistof: superkritische-fluïd-chromatografie (SFC). De methoden worden verder onderverdeeld naar stationaire fase; als de stationaire fase een vast adsorbens is, zijn er methoden als gas-vaste-chromatografie (GSC) en vloeistof-vaste-chromatografie (LSC). Chromatografie wordt uitgevoerd met computergestuurde instrumenten voor hoge precisie en onbemande werking. Bovendien wordt na de kolom vaak een detector on-line geplaatst voor analyse van de structuur, kwantificering of beide. Een van de krachtigste analysemethoden die thans beschikbaar zijn, is de on-line-koppeling van chromatografie aan massaspectrometrie.
Gaschromatografie is een belangrijke methode vanwege de snelheid, het oplossend vermogen en de gevoeligheid van de detector. Aangezien deze techniek afhankelijk is van verdamping, is zij het meest geschikt voor verbindingen die kunnen worden verdampt zonder dat ontleding optreedt. Veel stoffen die normaal gesproken niet gemakkelijk verdampen, kunnen chemisch worden gederivatiseerd voor een succesvolle vervluchtigingsscheiding door middel van gaschromatografie.
Naast chromatografie wordt voor zuivering ook veel gebruik gemaakt van gas/vaste-distributie, waarbij speciale adsorbentia worden gebruikt die moleculaire zeven worden genoemd. Deze materialen bevatten poriën van ongeveer dezelfde afmetingen als kleine moleculen. Deze eigenschap kan worden benut bij de scheiding van moleculen met een lineaire structuur van moleculen met een volumineuze structuur. De eerste kunnen gemakkelijk de poriën binnendringen, maar de tweede niet. Dit is een voorbeeld van een uitsluitingsmechanisme van scheiding (gebaseerd op vormverschillen). Moleculaire zeven spelen ook een belangrijke rol bij het drogen van gassen: water, een polaire stof (d.w.z. dat de netto positieve en negatieve elektrische ladingen ongelijk verdeeld zijn binnen het molecuul), wordt gemakkelijk geadsorbeerd aan de deeltjes, maar gassen die minder polair zijn, worden niet vastgehouden.
In sublimatie, een andere methode van gas/vaste verdeling, verdampt een vaste stof zonder door de vloeibare toestand te gaan. Aangezien niet alle stoffen sublimeren, is de toepasbaarheid van de methode beperkt.
Sinds het begin van de jaren zeventig heeft de vloeistofchromatografie zich ontwikkeld tot de belangrijkste scheidingsmethode voor organische stoffen. Omdat de mobiele fase een vloeistof is, is verdamping niet meer nodig en kan LC een veel breder scala van stoffen scheiden dan GC. Soorten die met succes zijn opgelost zijn onder meer anorganische ionen, aminozuren, geneesmiddelen, suikers, oligonucleotiden en eiwitten. Zowel vloeistofchromatografie op analytische schaal met monsters op het niveau van microgrammen tot milligrammen als preparatieve vloeistofchromatografie op het niveau van tientallen grammen zijn ontwikkeld. In de biotechnologie is preparatieve-schaal vloeistofchromatografie vooral belangrijk voor de zuivering van eiwitten en peptidehormonen die met recombinante technologie zijn gemaakt.
Een belangrijke methode is vloeistof-vaste-stofchromatografie waarbij het poreuze adsorptiemiddel polair is en de scheiding is gebaseerd op de eigenschappen van klassen van verbindingen – bijvoorbeeld aminen (alkalisch) van alcoholen (neutraal) en esters (neutraal) van zuren.
Vaste-vloeistofchromatografie is de oudste van de chromatografische methoden. Tot het midden van de 20e eeuw was de experimentele procedure niet veel veranderd ten opzichte van zijn oorspronkelijke vorm. Na aanzienlijke verbeteringen wordt vloeistof-vaste-chromatografie nu uitgevoerd met poreuze deeltjes met een diameter van 3-5 micrometer (0,00012-0,00020 inch), waarbij vloeistofpompen worden gebruikt om de vloeistof door de met deeltjes gevulde kolom te stuwen. Er worden hoge resoluties en snelle scheidingen bereikt aangezien de kleine deeltjes een goede efficiëntie mogelijk maken met snelle mobiele fasesnelheden (één centimeter per seconde of hoger). Deze techniek is ook belangrijk bij de zuivering, waarbij de gescheiden stoffen na de kolom automatisch kunnen worden opgevangen met behulp van een fractiecollector.
Een belangrijke vloeistof-vaste-chromatografieprocedure is omgekeerde-fasechromatografie, waarbij de vloeibare mobiele fase water is gecombineerd met een organisch oplosmiddel zoals methanol of acetonitril en het oppervlak van de stationaire fase apolair of koolwaterstofachtig is. In tegenstelling tot normale-fasechromatografie, waarbij het adsorberende oppervlak polair is, vindt bij omgekeerde-fasechromatografie de elutie van stoffen uit de kolom plaats in de volgorde van toenemende polariteit. Bovendien is de scheiding gebaseerd op de apolaire aspecten van de stoffen. Bij de scheiding van een reeks peptiden van menselijk groeihormoon, een recombinant gemaakt geneesmiddel, wordt een enzym, trypsine, gebruikt om peptidebindingen te verbreken die de basische aminozuren -arganine en lysine- bevatten, zodat een specifieke vingerafdruk van het eiwit wordt verkregen. Het in kaart brengen van peptiden is een kritische methode voor het evalueren van de zuiverheid van complexe stoffen zoals eiwitten.
Ion-exchange chromatography (IEC) is een onderafdeling van de vloeistof-vaste stof chromatografie, maar het belang ervan is zo groot dat het een speciale vermelding verdient. Zoals de naam al aangeeft, worden bij dit proces ionen gescheiden; de basis van de scheiding is de wisselende aantrekkingskracht van verschillende ionen in een oplossing op tegengesteld geladen plaatsen op een fijn verdeelde, onoplosbare stof (de ionenwisselaar, gewoonlijk een kunsthars). In een kationenwisselingshars zijn alle plaatsen negatief geladen, zodat alleen positieve ionen kunnen worden afgescheiden; een anionenwisselingshars heeft positief geladen plaatsen. Ionenwisselingschromatografie is een van de belangrijkste methoden geworden voor het scheiden van eiwitten en kleine oligonucleotiden.
Een belangrijke toepassing van ionenwisseling is de verwijdering van opgeloste ijzer-, calcium-, en magnesiumionen uit hard water. De negatieve plaatsen op een kationenwisselaar worden eerst geneutraliseerd met natriumionen door blootstelling aan een sterke oplossing van gewoon zout (natriumchloride); wanneer het harde water door de hars wordt geleid, worden de ongewenste ionen in het water vervangen door natriumionen.
Liquid-solid adsorption chromatography also can be performed on thin, flat plates (thin-layer chromatography, of TLC). TLC is goedkoop en snel, maar niet zo gevoelig of efficiënt als kolomchromatografie. In de praktijk wordt het adsorptiemiddel op een glasplaat uitgesmeerd en gedroogd. Het monster wordt aangebracht als een vlek nabij één uiteinde van de plaat, die (verticaal) in een ondiep reservoir met de mobiele fase wordt geplaatst. Terwijl de mobiele fase zich door capillaire werking over de plaat verplaatst, lost het monster in de vloeistof op en worden de bestanddelen ervan over de plaat getransporteerd naar nieuwe posities op verschillende afstanden van het beginpunt. (Zie voor verdere discussie het artikel chromatografie.)