In vivo is chymotrypsine een proteolytisch enzym (serine protease) dat in het spijsverteringsstelsel van veel organismen voorkomt. Het vergemakkelijkt de splitsing van peptidebindingen door een hydrolysereactie, die ondanks het feit dat zij thermodynamisch gunstig is, uiterst langzaam verloopt in afwezigheid van een katalysator. De voornaamste substraten van chymotrypsine zijn peptidebindingen waarbij het aminozuur N-terminaal van de binding een tryptofaan, tyrosine, fenylalanine of leucine is. Zoals vele proteasen hydrolyseert chymotrypsine ook amidebindingen in vitro, een eigenschap die het gebruik van substraatanalogen zoals N-acetyl-L-fenylalanine p-nitrofenyl amide voor enzymtests mogelijk maakte.
Chymotrypsine splitst peptidebindingen door de onreactieve carbonylgroep aan te vallen met een krachtig nucleofiel, het residu serine 195 in de actieve site van het enzym, dat kortstondig een covalente binding aangaat met het substraat, waardoor een enzym-substraattussenproduct wordt gevormd. Samen met histidine 57 en asparaginezuur 102 vormt dit serineresidu de katalytische triade van de actieve site.
Deze bevindingen berusten op remmingstests en de studie van de kinetiek van de splitsing van bovengenoemd substraat, waarbij gebruik wordt gemaakt van het feit dat het enzym-substraattussenproduct p-nitrofenolaat een gele kleur heeft, waardoor de concentratie ervan kan worden gemeten door de lichtabsorptie bij 410 nm te meten.
De reactie van chymotrypsine met zijn substraat bleek in twee fasen plaats te vinden, een eerste “burst”-fase bij het begin van de reactie en een steady-state fase volgens de Michaelis-Menten-kinetiek. De werkingswijze van chymotrypsine verklaart dit doordat de hydrolyse in twee stappen plaatsvindt. Eerst acylering van het substraat, waarbij een tussenproduct van het acyl-enzym wordt gevormd, en vervolgens deacylering om het enzym in zijn oorspronkelijke toestand terug te brengen. Dit gebeurt door de gecoördineerde werking van de drie aminozuurresiduen in de katalytische triade. Aspartaat bindt zich met waterstof aan de N-δ waterstof van histidine, waardoor de pKa van zijn ε stikstof toeneemt en het in staat is serine te deprotoneren. Door deze deprotonatie kan de serine-zijketen als nucleofiel fungeren en zich binden aan de elektron-deficiënte carbonylkoolstof van de hoofdketen van het eiwit. Ionisatie van de carbonylzuurstof wordt gestabiliseerd door vorming van twee waterstofbruggen met aangrenzende N-hydrogenen van de hoofdketen. Dit gebeurt in het oxyaniongat. Dit vormt een tetrahedraal adduct en verbreking van de peptidebinding. Een acyl-enzymatussenproduct, gebonden aan het serine, wordt gevormd, en de nieuw gevormde amino-terminus van het gesplitste eiwit kan dissociëren. In de tweede reactiestap wordt een watermolecuul geactiveerd door het basische histidine, en fungeert als nucleofiel. De zuurstof van het water valt de carbonylkoolstof van de serine-gebonden acylgroep aan, wat resulteert in de vorming van een tweede tetrahedraal adduct, regeneratie van de serine -OH groep, en het vrijkomen van een proton, alsmede het eiwitfragment met de nieuw gevormde carboxyl terminus