Lymfocyten Oogst
Voor de productie van monoklonale antilichamen moeten de antilichaamproducerende cellen in de milt of lymfeknopen worden verzameld.
Fusie om hybridoma-cellen te creëren
Aangezien miltcellen een beperkte overlevingstijd in cultuur hebben, moeten zij worden gefuseerd met myeloma’s, kankerende B-cellen, om een geïmmortaliseerde hybride te creëren die vele passages in vitro kan ondergaan. Dit wordt bereikt door polyethyleenglycol (PEG) of elektrische pulsen die beide het celmembraan verstoren en de samensmelting van twee aangrenzende cellen mogelijk maken.
Selecteren op gesmolten hybriden
B-cel en myeloma fusie is niet 100% efficiënt. Daarom moet worden geselecteerd op myeloma-lymfocytenhybriden. Hypoxanthine-aminopterine-thymidine-medium (HAT) remt de DNA-synthese via aminopterine. B-cellen en gefuseerde hybriden kunnen de kweek in HAT-medium overwinnen, aangezien zij thymidinekinase bezitten, waardoor zij de vereiste DNA-polymerase-precursoren kunnen synthetiseren uit het door het HAT-medium geleverde thymidine. Myeloma’s produceren geen thymidinekinase en kunnen bijgevolg niet overleven in HAT-medium. Hoewel sterfelijke B-cellen thymidinekinase bevatten, sterven zij uiteindelijk af als gevolg van een beperkt in vitro replicatievermogen.
Het bereiken van klonaliteit met beperkende verdunningen
De populatie cellen die selectie overleeft, is nog steeds heterogeen en bevat zowel meervoudige klonen die specifiek zijn voor het doelantigeen als klonen die antilichamen produceren met irrelevante specificiteit. Om de klonaliteit te waarborgen zijn afzonderlijke cellen nodig, die worden verkregen door limiterende verdunningen. Limiterende verdunning is een techniek waarbij de uitplante concentraties van de heterogene populatie zodanig worden verdund dat statistisch gezien elk putje één cel zal bevatten. In de praktijk kunnen sommige putjes geen cellen bevatten, andere één cel en nog andere meerdere cellen. Door dit proces echter na expansierondes te herhalen, wordt verzekerd dat elk putje slechts de expansie van één enkele cel bevat, wat resulteert in de productie van identieke monoklonale antilichamen. Elke potentiële kloon moet ten minste via supernatant screening in een ELISA tegen het antigeen worden getest. Het supernatans van klonen kan ook worden gescreend voor specifieke toepassingen voordat naar de volgende fase wordt overgegaan.
Uitbreiding, cryopreservatie, productie en zuivering
Na het bereiken van de monoklonale status en succesvolle prestaties in screeningtests, worden geselecteerde hybridoma’s uitgebreid en ingevroren in overtollige voorraden ter bescherming en bewaring. Terugkeren naar deze monoklonale antilichaamvoorraden zorgt voor consistentie van batch tot batch en betrouwbare antilichaamprestaties. Hybridoma’s voor de productie van antilichamen kunnen in vivo worden geëxpandeerd door injectie in het buikvlies van een gastheer. Deze eenvoudige techniek, bekend als ascitesproductie, is uit de gratie geraakt omdat zij voor het gastdier zeer oncomfortabel kan zijn. Als alternatief kunnen met grootschalige in vitro-technieken, zoals de productie in rolflessen, liters worden geproduceerd, waarmee de ascites-technieken ver worden overtroffen. Tenslotte is een eenvoudige zuivering om immunoglobuline te vangen via proteïne A/G alles wat nodig is om zuiver antilichaam terug te krijgen, aangezien alle andere ongewenste immunoglobulinen zijn verwijderd in de beperkende verdunnings- en screeningsfasen.