Chromatografia, jak wspomniano powyżej, jest procesem rozdzielania z udziałem dwóch faz, jednej stacjonarnej i drugiej ruchomej. Zazwyczaj fazą stacjonarną jest porowate ciało stałe (np. szkło, krzemionka lub tlenek glinu), które jest umieszczone w szklanej lub metalowej rurce lub które stanowi ścianki otwartej kapilary. Faza ruchoma przepływa przez upakowane złoże lub kolumnę. Próbka, która ma zostać rozdzielona, jest wstrzykiwana na początku kolumny i jest transportowana przez system za pomocą fazy ruchomej. Podczas przemieszczania się przez kolumnę, różne substancje rozprowadzają się zgodnie z ich względnym powinowactwem do dwóch faz. Szybkość przemieszczania się zależy od wartości współczynników podziału, przy czym składniki silniej oddziałujące z fazą stacjonarną wymagają dłuższych okresów elucji (całkowitego usunięcia z kolumny). Tak więc rozdzielanie opiera się na różnicach w zachowaniu dystrybucyjnym, odzwierciedlonych w różnych czasach migracji przez kolumnę. Podobnie jak w ekstrakcji powtarzalnej, im większy jest współczynnik rozdzielenia dla pary składników, tym krótsza będzie kolumna niezbędna do ich rozdzielenia. Chromatografia jest zatem analogiczna do ekstrakcji wieloetapowej, z tą różnicą, że w chromatografii nie ma nieciągłych etapów, lecz raczej ciągły przepływ. Obecnie chromatografia jest najważniejszą metodą rozdzielania substancji organicznych i obok elektroforezy jest najszerzej stosowana do substancji biologicznych.
Różne metody chromatograficzne są charakteryzowane pod względem fazy ruchomej – gazowej: chromatografia gazowa (GC); cieczowej: chromatografia cieczowa (LC); cieczy w stanie nadkrytycznym: chromatografia w stanie nadkrytycznym (SFC). Metody te są następnie dalej dzielone ze względu na fazę stacjonarną; tak więc, jeżeli fazą stacjonarną jest stały adsorbent, istnieją metody takie jak chromatografia gazowo-stała (GSC) i chromatografia cieczowo-stała (LSC). Chromatografia jest przeprowadzana przy użyciu oprzyrządowania sterowanego komputerowo, co zapewnia wysoką precyzję i możliwość pracy bez nadzoru. Dodatkowo, za kolumną często umieszcza się on-line detektor do analizy strukturalnej, ilościowej lub obu. Jednym z najpotężniejszych dostępnych obecnie podejść analitycznych jest sprzężenie on-line chromatografii ze spektrometrią mas.
Chromatografia gazowa jest ważną metodą ze względu na jej szybkość, zdolność rozdzielczą i czułość detektora. Ponieważ zależy ona od parowania, technika ta najlepiej nadaje się do związków, które mogą być odparowywane bez ulegania rozkładowi. Wiele substancji, które normalnie niełatwo odparowują, może być chemicznie derywatyzowanych w celu skutecznego oddzielenia ich za pomocą chromatografii gazowej.
Oprócz chromatografii, rozdział gaz-ciało stałe jest również szeroko stosowany do oczyszczania, przy użyciu specjalnych adsorbentów zwanych sitami molekularnymi. Materiały te zawierają pory o mniej więcej takich samych wymiarach jak małe cząsteczki. Ta właściwość może być wykorzystana do oddzielenia cząsteczek o strukturze liniowej od tych o strukturze wielkogabarytowej. Te pierwsze mogą z łatwością wnikać w pory, natomiast te drugie nie są w stanie. Jest to przykład wykluczającego mechanizmu separacji (opartego na różnicach kształtu). Sita molekularne odgrywają również ważną rolę w suszeniu gazów: woda, substancja polarna (tzn. jej dodatnie i ujemne ładunki elektryczne są nierównomiernie rozłożone w cząsteczce), jest łatwo adsorbowana na cząsteczkach, ale gazy, które są mniej polarne, nie są zatrzymywane.
W sublimacji, innej metodzie rozdziału gaz-ciało stałe, ciało stałe odparowuje bez przechodzenia w stan ciekły. Ponieważ nie wszystkie substancje sublimują, możliwości zastosowania tej metody są ograniczone.
Od początku lat 70. chromatografia cieczowa stała się główną metodą rozdzielania substancji organicznych. Ponieważ fazą ruchomą jest ciecz, wymóg odparowania został wyeliminowany, a zatem LC może rozdzielić znacznie szerszy zakres substancji niż GC. Gatunki, które zostały pomyślnie rozdzielone, obejmują jony nieorganiczne, aminokwasy, leki, cukry, oligonukleotydy i białka. Opracowano zarówno chromatografię cieczową w skali analitycznej dla próbek na poziomie od mikrograma do miligrama, jak i chromatografię cieczową w skali preparatywnej na poziomie dziesiątek gramów. W biotechnologii chromatografia cieczowa w skali preparatywnej jest szczególnie ważna przy oczyszczaniu białek i hormonów peptydowych wytwarzanych w technologii rekombinacji.
Jedną z ważnych metod jest chromatografia ciecz-ciało stałe, w której porowaty adsorbent jest polarny, a rozdział opiera się na właściwościach klas związków – np. amin (zasadowych) od alkoholi (obojętnych) i estrów (obojętnych) od kwasów.
Chromatografia ciecz-ciało stałe jest najstarszą z metod chromatograficznych. Do połowy XX wieku procedura doświadczalna nie uległa większym zmianom w stosunku do jej pierwotnej postaci. Po znacznych ulepszeniach, chromatografia ciecz-ciało stałe jest obecnie przeprowadzana z porowatymi cząstkami o średnicy zaledwie 3-5 mikrometrów (0,00012-0,00020 cala), a pompy cieczowe są używane do napędzania cieczy przez kolumnę wypełnioną cząstkami. Wysoka rozdzielczość i szybkie separacje są osiągane, ponieważ małe cząsteczki umożliwiają dobrą wydajność przy szybkich prędkościach fazy ruchomej (jeden centymetr na sekundę lub więcej). Technika ta jest również ważna w oczyszczaniu, a rozdzielone substancje mogą być automatycznie zbierane po kolumnie za pomocą kolektora frakcji.
Ważną procedurą chromatografii ciecz-ciało stałe jest chromatografia fazy odwróconej, w której ciekłą fazą ruchomą jest woda połączona z rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak metanol lub acetonitryl, a powierzchnia fazy stacjonarnej jest niepolarna lub podobna do węglowodoru. W przeciwieństwie do chromatografii w normalnej fazie, gdzie powierzchnia adsorbentu jest polarna, w chromatografii w odwróconej fazie elucja substancji z kolumny następuje w kolejności wzrastającej polarności. Ponadto, rozdział opiera się na niepolarnych aspektach substancji. W rozdziale serii peptydów z ludzkiego hormonu wzrostu, rekombinowanego leku, enzym, trypsyna, jest używany do rozbijania wiązań peptydowych zawierających podstawowe aminokwasy – arganinę i lizynę – w celu uzyskania specyficznego odcisku palca białka. Mapowanie peptydów jest krytyczną metodą oceny czystości złożonych substancji, takich jak białka.
Chromatografia jonowymienna (IEC) jest poddziałem chromatografii cieczowo-stałej, ale jej znaczenie jest tak duże, że zasługuje na specjalną wzmiankę. Jak sama nazwa wskazuje, proces ten polega na rozdzielaniu jonów; podstawą rozdzielania jest zmienne przyciąganie różnych jonów w roztworze do przeciwnie naładowanych miejsc w drobno podzielonej, nierozpuszczalnej substancji (wymieniacz jonowy, zwykle żywica syntetyczna). W żywicy kationowymiennej wszystkie miejsca są naładowane ujemnie, tak że można oddzielić tylko jony dodatnie; żywica anionowymienna ma miejsca naładowane dodatnio. Chromatografia jonowymienna stała się jedną z najważniejszych metod rozdzielania białek i małych oligonukleotydów.
Ważnym zastosowaniem wymiany jonowej jest usuwanie rozpuszczonych jonów żelaza, wapnia i magnezu z twardej wody. Ujemne miejsca na wymieniaczu kationowym są najpierw neutralizowane jonami sodu przez ekspozycję na silny roztwór soli kuchennej (chlorek sodu); kiedy twarda woda jest przepuszczana przez żywicę, niepożądane jony w wodzie są zastępowane jonami sodu.
Chromatografia adsorpcyjna ciecz-ciało stałe również może być wykonywana na cienkich, płaskich płytkach (chromatografia cienkowarstwowa, lub TLC). TLC jest niedroga i szybka, ale nie tak czuła i wydajna jak chromatografia kolumnowa. W praktyce, adsorbent jest rozprowadzany na szklanej płytce i suszony. Próbka jest nanoszona jako plamka w pobliżu jednego końca płytki, która jest umieszczona (pionowo) w płytkim zbiorniku zawierającym fazę ruchomą. W miarę jak faza ruchoma przemieszcza się w górę płytki na skutek działania kapilarnego, próbka rozpuszcza się w cieczy, a jej składniki są transportowane w górę płytki do nowych pozycji w różnych odległościach od punktu początkowego. (Więcej informacji na ten temat można znaleźć w artykule Chromatografia.)