In vivo, chymotrypsyna jest enzymem proteolitycznym (proteazą serynową) działającym w układach pokarmowych wielu organizmów. Ułatwia rozszczepianie wiązań peptydowych na drodze reakcji hydrolizy, która mimo że jest termodynamicznie korzystna, zachodzi niezwykle wolno przy braku katalizatora. Głównym substratem chymotrypsyny są wiązania peptydowe, w których aminokwasem N-końca wiązania jest tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina lub leucyna. Jak wiele proteaz, chymotrypsyna również hydrolizuje wiązania amidowe in vitro, co umożliwiło zastosowanie analogów substratów, takich jak p-nitrofenyloamid N-acetylo-L-fenyloalaniny do oznaczeń enzymatycznych.
Chymotrypsyna rozszczepia wiązania peptydowe atakując niereaktywną grupę karbonylową silnym nukleofilem, resztą serynową 195 znajdującą się w miejscu aktywnym enzymu, która na krótko wiąże się kowalencyjnie z substratem, tworząc intermediat enzym-substrat. Wraz z histydyną 57 i kwasem asparaginowym 102, ta reszta serynowa stanowi triadę katalityczną miejsca aktywnego.
Odkrycia te opierają się na testach inhibicji i badaniu kinetyki rozszczepiania wyżej wymienionego substratu, wykorzystując fakt, że pośredni enzym-substrat p-nitrofenolan ma żółte zabarwienie, co umożliwia pomiar jego stężenia poprzez pomiar absorbancji światła przy 410 nm.
Reakcja chymotrypsyny z substratem przebiega dwuetapowo, z fazą początkową „burst” na początku reakcji i fazą ustaloną, przebiegającą zgodnie z kinetyką Michaelisa-Mentena. Sposób działania chymotrypsyny wyjaśnia to w ten sposób, że hydroliza przebiega w dwóch etapach. Najpierw następuje acylacja substratu w celu utworzenia acylo-enzymu pośredniego, a następnie deacylacja w celu powrotu enzymu do stanu wyjściowego. Dzieje się to dzięki skoordynowanemu działaniu trzech reszt aminokwasowych w triadzie katalitycznej. Asparaginian wiąże się wodorowo z wodorem N-δ histydyny, zwiększając pKa jej azotu ε, co umożliwia deprotonowanie seryny. Deprotonacja ta pozwala łańcuchowi bocznemu seryny działać jako nukleofil i wiązać się z pozbawionym elektronów węglem karbonylowym łańcucha głównego białka. Jonizacja tlenu karbonylowego jest stabilizowana przez utworzenie dwóch wiązań wodorowych z sąsiednimi N-hydrogenami łańcucha głównego. Dzieje się to w otworze oksyanionowym. Tworzy to tetraedryczny addukt i przerywa wiązanie peptydowe. Powstaje acylo-enzymowy intermediat związany z seryną, a nowo utworzony aminowy terminus rozszczepionego białka może ulec dysocjacji. W drugim etapie reakcji cząsteczka wody jest aktywowana przez zasadową histydynę i działa jako nukleofil. Tlen wody atakuje węgiel karbonylowy grupy acylowej związanej z seryną, w wyniku czego powstaje drugi addukt tetraedryczny, regeneracja grupy serynowej -OH i uwolnienie protonu, a także fragment białka z nowo utworzonym terminusem karboksylowym