Zbieranie limfocytów
Produkcja przeciwciał monoklonalnych wymaga zbierania komórek wytwarzających przeciwciała, znajdujących się w śledzionie lub węzłach chłonnych.
Fuzja w celu stworzenia komórek Hybridoma
Jako, że komórki śledziony mają ograniczony czas przeżycia w hodowli, wymagają fuzji ze szpiczakami, nowotworowymi komórkami B, w celu stworzenia nieśmiertelnej hybrydy, która może być poddana wielu pasażom in vitro. Osiąga się to poprzez glikol polietylenowy (PEG) lub impulsy elektryczne, które przerywają membranę komórkową i pozwalają na połączenie się dwóch sąsiadujących komórek.
Wybór hybryd
Fuzja komórek B i szpiczaka nie jest w 100% skuteczna. Dlatego konieczna jest selekcja hybryd szpiczak-limfocyt. Podłoże hipoksantyna-aminopteryna-tymidyna (HAT) hamuje syntezę DNA poprzez aminopteryny. Komórki B i hybrydy fuzji mogą przezwyciężyć hodowlę w podłożu HAT, ponieważ posiadają kinazę tymidynową, która pozwala im syntetyzować wymagane prekursory polimerazy DNA z dostarczanej w podłożu HAT tymidyny. Szpiczaki nie wytwarzają kinazy tymidynowej i w konsekwencji nie przeżywają w pożywce HAT. Chociaż śmiertelne komórki B zawierają kinazę tymidynową, ostatecznie obumierają z powodu ograniczonej zdolności replikacji in vitro.
Osiągnięcie klonalności przy ograniczonych rozcieńczeniach
Populacja komórek, które przetrwały selekcję jest nadal heterogenna, zawierająca zarówno wiele klonów specyficznych dla docelowego antygenu jak i klony produkujące przeciwciała o nieistotnej specyficzności. W celu zapewnienia klonalności wymagane są pojedyncze komórki, co uzyskuje się poprzez rozcieńczenia limitujące. Rozcieńczanie ograniczające jest techniką, która rozcieńcza stężenia posiewu heterogenicznej populacji tak, że statystycznie każdy dołek będzie zawierał jedną komórkę. W praktyce, niektóre studzienki mogą nie zawierać żadnych komórek, niektóre pojedynczą komórkę, a inne wiele komórek. Jednakże, powtarzanie tego procesu po rundach ekspansji zapewni, że każdy dołek będzie zawierał tylko ekspansję pojedynczej komórki, a zatem skutkować będzie produkcją identycznych przeciwciał monoklonalnych. Każdy potencjalny klon powinien być co najmniej testowany poprzez przesiewanie supernatantu w teście ELISA przeciwko antygenowi. Supernatant klonów może być również badany pod kątem specyficznych zastosowań przed przejściem do następnego etapu.
Ekspansja, kriokonserwacja, produkcja i oczyszczanie
Po osiągnięciu statusu monoklonalnego i pomyślnych wynikach w testach przesiewowych, wybrane hybrydomaty są ekspandowane i zamrażane w nadmiarowych zapasach w celu zabezpieczenia i konserwacji. Powrót do tych zapasów przeciwciał monoklonalnych pozwala na zachowanie spójności pomiędzy poszczególnymi partiami i niezawodne działanie przeciwciał. Hybrydomaty do produkcji przeciwciał mogą być ekspandowane in vivo poprzez wstrzyknięcie do otrzewnej gospodarza. Ta prosta technika znana jako produkcja wodobrzusza wypadła z łask, ponieważ może być bardzo niewygodna dla zwierzęcia-gospodarza. Alternatywnie, wielkoskalowe techniki in vitro, takie jak produkcja w butelce z cylindrem, pozwalają na produkcję na skalę litrową, znacznie przewyższając techniki wykorzystujące wodobrzusze. Wreszcie, proste oczyszczanie w celu wychwycenia immunoglobuliny przez białko A/G jest wszystkim, co jest wymagane do odzyskania czystego przeciwciała, ponieważ wszystkie inne niepożądane immunoglobuliny zostały usunięte w rozcieńczeniu ograniczającym i na etapach przesiewowych.