In vivo, a quimotripsina é uma enzima proteolítica (serine protease) que actua no sistema digestivo de muitos organismos. Ela facilita a clivagem das ligações do peptídeo por uma reação de hidrólise, que apesar de ser termodinamicamente favorável, ocorre extremamente lentamente na ausência de um catalisador. Os principais substratos da quimotripsina são ligações peptídeas nas quais o aminoácido N-terminal da ligação é um triptofano, tirosina, fenilalanina, ou leucina. Como muitas proteases, a quimotripsina também hidrolisa ligações amídicas in vitro, uma virtude que permitiu o uso de substratos análogos como N-acetil-L-fenilalanina p-nitrofenil amida para ensaios enzimáticos.
Chymotrypsin clivagem ligações peptídeo atacando o grupo carbonilo não reactivo com um nucleófilo poderoso, o resíduo de serina 195 localizado no local ativo da enzima, que se torna brevemente ligado covalentemente ao substrato, formando um intermediário enzimático-substrato. Juntamente com a histidina 57 e o ácido aspártico 102, este resíduo de serina constitui a tríade catalítica do local ativo.
Estes achados baseiam-se em ensaios de inibição e no estudo da cinética de clivagem do substrato acima mencionado, explorando o fato de que o p-nitrofenolato intermediário enzimático-substrato tem uma cor amarela, permitindo a medição de sua concentração através da medição da absorvância da luz a 410 nm.
A reacção da quimotripsina com o seu substrato ocorreu em duas fases, uma fase inicial de “rebentamento” no início da reacção e uma fase de estado estacionário seguindo a cinética de Michaelis-Menten. O modo de ação da quimotripsina explica isso porque a hidrólise ocorre em duas etapas. Primeiro, a acitilação do substrato para formar uma enzima intermediária acil-enzima, e depois a decitilação para devolver a enzima ao seu estado original. Isto ocorre através da acção concertada dos resíduos de três aminoácidos na tríade catalítica. O hidrogênio aspartato liga-se ao hidrogênio N-δ da histidina, aumentando a pKa do seu ε nitrogênio, tornando-o assim capaz de desprotonar a serina. Essa desprotonificação permite que a cadeia lateral da serina atue como nucleófilo e se ligue ao carbono carbonilo deficiente em elétrons da cadeia principal da proteína. A ionização do oxigênio carbonilo é estabilizada pela formação de duas ligações de hidrogênio a N-hidrogênios da cadeia principal adjacente. Isto ocorre no buraco do oxianião. Isto forma um aduto tetraédrico e quebra da ligação do peptídeo. Forma-se uma enzima intermediária acilo, ligada à serina, e o amino terminal recém formado da proteína clivada pode dissociar-se. Na segunda etapa de reacção, uma molécula de água é activada pela histidina básica, e actua como nucleófilo. O oxigênio da água ataca o carbono carbonilo do grupo acilo sereno, resultando na formação de um segundo aduto tetraédrico, regeneração do grupo sereno -OH, e liberação de um próton, bem como o fragmento proteico com o terminal carboxil recém-formado