Cromatografia, așa cum s-a menționat mai sus, este un proces de separare care implică două faze, una staționară și cealaltă mobilă. În mod obișnuit, faza staționară este un solid poros (de exemplu, sticlă, silice sau alumină) care este ambalat într-un tub de sticlă sau metal sau care constituie pereții unui tub capilar deschis. Faza mobilă curge prin patul sau coloana împachetată. Proba care urmează să fie separată este injectată la începutul coloanei și este transportată prin sistem de către faza mobilă. În timpul deplasării lor prin coloană, diferitele substanțe se distribuie în funcție de afinitatea lor relativă pentru cele două faze. Viteza de deplasare depinde de valorile coeficienților de distribuție, componentele care interacționează mai puternic cu faza staționară necesitând perioade mai lungi de timp pentru eluție (eliminarea completă din coloană). Astfel, separarea se bazează pe diferențele în comportamentul de distribuție reflectate în timpii diferiți de migrare prin coloană. Ca și în cazul extracției repetitive, cu cât factorul de separare este mai mare pentru o pereche de componente, cu atât mai scurtă va fi coloana necesară pentru a le separa. Astfel, cromatografia este analogă extracției în mai multe etape, cu excepția faptului că în cromatografie nu există etape discontinue, ci mai degrabă un flux continuu. În prezent, cromatografia este cea mai importantă metodă de separare a substanțelor organice și, împreună cu electroforeza, este cea mai utilizată pentru substanțele biologice.
Diferitele metode cromatografice sunt caracterizate în funcție de faza mobilă – gaz: cromatografie în fază gazoasă (GC); lichidă: cromatografie în fază lichidă (LC); cu fluid supercritic: cromatografie cu fluid supercritic (SFC). Metodele sunt apoi subdivizate în funcție de faza staționară; astfel, dacă faza staționară este un adsorbant solid, există metode cum ar fi cromatografia gaz-solid (GSC) și cromatografia lichid-solid (LSC). Cromatografia se realizează cu ajutorul unor instrumente controlate de calculator pentru o precizie ridicată și o funcționare nesupravegheată. În plus, un detector este frecvent plasat on-line după coloană, fie pentru analiza structurii, fie pentru cuantificare, fie pentru ambele. Una dintre cele mai puternice abordări de analiză disponibile în prezent este cuplarea on-line a cromatografiei cu spectrometria de masă.
Cromatografia în fază gazoasă este o metodă importantă datorită vitezei, puterii de rezoluție și sensibilității detectorului. Deoarece depinde de vaporizare, această tehnică este cea mai potrivită pentru compușii care pot fi vaporizați fără a suferi descompunere. Multe substanțe care, în mod normal, nu se vaporizează cu ușurință pot fi derivate chimic pentru o separare reușită a volatilizării prin cromatografie în fază gazoasă.
În plus față de cromatografie, distribuția gaz-solid este, de asemenea, utilizată pe scară largă pentru purificare, folosind adsorbanți speciali numiți site moleculare. Aceste materiale conțin pori de aproximativ aceleași dimensiuni ca și moleculele mici. Această proprietate poate fi exploatată în separarea moleculelor cu structură liniară de cele cu structură voluminoasă. Primele pot intra cu ușurință în pori, dar cele din urmă sunt incapabile să pătrundă. Acesta este un exemplu de mecanism de separare prin excludere (bazat pe diferențe de formă). Sitele moleculare joacă, de asemenea, un rol important în uscarea gazelor: apa, o substanță polară (adică sarcinile sale electrice nete pozitive și negative sunt distribuite inegal în moleculă), este ușor adsorbită pe particule, dar gazele care sunt mai puțin polare nu sunt reținute.
În sublimare, o altă metodă de distribuire a gazelor-solide, un solid se evaporă fără a trece prin starea lichidă. Deoarece nu toate substanțele se sublimează, aplicabilitatea metodei este limitată.
De la începutul anilor 1970, cromatografia lichidă s-a dezvoltat ca principală metodă de separare a substanțelor organice. Deoarece faza mobilă este un lichid, se elimină cerința de vaporizare și, prin urmare, LC poate separa o gamă mult mai largă de substanțe decât GC. Speciile care au fost rezolvate cu succes includ ioni anorganici, aminoacizi, medicamente, zaharuri, oligonucleotide și proteine. Au fost dezvoltate atât cromatografia lichidă la scară analitică cu probe la nivel de micrograme până la miligrame, cât și cromatografia lichidă la scară pregătitoare la nivel de zeci de grame. În biotehnologie, cromatografia lichidă la scară pregătitoare este deosebit de importantă pentru purificarea proteinelor și a hormonilor peptidici obținuți prin tehnologie recombinantă.
O metodă importantă este cromatografia lichid-solid în care adsorbantul poros este polar, iar separarea se bazează pe proprietățile claselor de compuși – de exemplu, aminele (alcaline) de alcooli (neutre) și esterii (neutri) de acizi.
Cromatografia lichid-solid este cea mai veche dintre metodele cromatografice. Până la mijlocul secolului al XX-lea, procedura experimentală nu s-a schimbat prea mult față de forma sa originală. După îmbunătățiri semnificative, în prezent, cromatografia lichid-solid se realizează cu particule poroase cu diametrul de 3-5 micrometri (0,00012-0,00020 inch), iar pompele de lichid sunt utilizate pentru a conduce lichidul prin coloana plină de particule. Se obțin rezoluții înalte și separări rapide, deoarece particulele mici permit o bună eficiență cu viteze rapide ale fazei mobile (un centimetru pe secundă sau mai mult). Această tehnică este, de asemenea, importantă în purificare, iar substanțele separate pot fi colectate automat după coloană cu ajutorul unui colector de fracții.
Un procedeu important de cromatografie lichid-solid este cromatografia în fază inversă, în care faza mobilă lichidă este apa combinată cu un solvent organic, cum ar fi metanol sau acetonitril, iar suprafața fazei staționare este nepolară sau asemănătoare hidrocarburilor. Spre deosebire de cromatografia în fază normală, în care suprafața adsorbantului este polară, în cromatografia în fază inversă, eluția substanțelor din coloană se face în ordinea creșterii polarității. În plus, separarea se bazează pe aspectele nepolare ale substanțelor. În separarea unei serii de peptide din hormonul de creștere uman, un medicament fabricat prin recombinare, se utilizează o enzimă, tripsina, pentru a rupe legăturile peptidice care conțin aminoacizii bazici – arganina și lizina – pentru a obține o amprentă specifică a proteinei. Cartografierea peptidelor este o metodă esențială pentru evaluarea purității substanțelor complexe, cum ar fi proteinele.
Cromatografia prin schimb de ioni (IEC) este o subdiviziune a cromatografiei lichid-solid, dar importanța sa este atât de mare încât merită o mențiune specială. După cum sugerează și numele, procesul separă ionii; baza separării este atracția variabilă a diferiților ioni dintr-o soluție față de situsurile cu sarcini opuse de pe o substanță insolubilă, fin divizată (schimbătorul de ioni, de obicei o rășină sintetică). Într-o rășină schimbătoare de cationi, toate situsurile sunt încărcate negativ, astfel încât numai ionii pozitivi pot fi separați; o rășină schimbătoare de anioni are situsuri încărcate pozitiv. Cromatografia schimbătoare de ioni a devenit una dintre cele mai importante metode de separare a proteinelor și a oligonucleotidelor mici.
O aplicație importantă a schimbului de ioni este îndepărtarea ionilor de fier, calciu și magneziu dizolvați din apa dură. Locurile negative de pe un schimbător de cationi sunt mai întâi neutralizate cu ioni de sodiu prin expunerea la o soluție puternică de sare comună (clorură de sodiu); când apa dură este trecută prin rășină, ionii indezirabili din apă sunt înlocuiți cu ioni de sodiu.
Cromatografia de adsorbție lichid-solid poate fi, de asemenea, realizată pe plăci subțiri, plate (cromatografie în strat subțire, sau TLC). TLC este ieftină și rapidă, dar nu la fel de sensibilă sau eficientă ca și cromatografia pe coloană. În practică, adsorbantul se întinde pe o placă de sticlă și se usucă. Proba este aplicată sub forma unui punct în apropierea unui capăt al plăcii, care este plasată (vertical) într-un rezervor de mică adâncime care conține faza mobilă. Pe măsură ce faza mobilă se deplasează în susul plăcii prin acțiune capilară, proba se dizolvă în lichid, iar componentele sale sunt transportate în susul plăcii către noi poziții la distanțe variabile față de punctul de plecare. (Pentru discuții suplimentare, consultați articolul cromatografie.)
.