Recoltarea limfocitelor
Pentru producerea de anticorpi monoclonali este necesară recoltarea celulelor producătoare de anticorpi care se găsesc în splină sau în ganglionii limfatici.
Fuziunea pentru a crea celule hibridom
Deoarece celulele splinei au o durată de supraviețuire limitată în cultură, acestea necesită fuziunea cu mielomii, celule B canceroase, pentru a crea un hibrid imortalizat care poate suferi numeroase treceri in vitro. Acest lucru se realizează prin polietilenglicol (PEG) sau prin impulsuri electrice, ambele perturbând membrana celulară și permițând fuziunea a două celule adiacente.
Selecția hibrizilor fuzionați
Fuziunea celulelor B și a mielomului nu este 100% eficientă. Prin urmare, este necesară selectarea hibrizilor mielom-linfocit. Mediul hipoxantină-aminopterină-timidină (HAT) inhibă sinteza ADN prin intermediul aminopterinei. Celulele B și hibrizii fuzionați pot depăși cultivarea în mediu HAT deoarece posedă timidină kinază, ceea ce le permite să sintetizeze precursorii ADN-polimerazei necesari din timidina furnizată de mediul HAT. Mieloamele nu produc timidină kinază și, prin urmare, nu supraviețuiesc în mediu HAT. Deși celulele B mortale conțin timidin kinază, acestea mor în cele din urmă din cauza capacității limitate de replicare in vitro.
Atingerea clonalității cu diluții limitative
Populația de celule care supraviețuiește selecției este încă eterogenă, conținând atât clone multiple specifice antigenului țintă, cât și clone care produc anticorpi cu specificitate irelevantă. Sunt necesare celule unice pentru a asigura clonalitatea și se realizează prin diluții limitative. Diluția limitativă este o tehnică prin care se diluează concentrațiile de plasmă ale populației eterogene astfel încât, din punct de vedere statistic, fiecare gode va conține o singură celulă. În practică, este posibil ca unele godeuri să nu conțină nicio celulă, altele să conțină o singură celulă, iar altele să conțină mai multe celule. Cu toate acestea, repetarea acestui proces după runde de expansiune va asigura că fiecare gode conține doar expansiunea unei singure celule și, prin urmare, duce la producerea de anticorpi monoclonali identici. Fiecare clonă potențială ar trebui să fie testată, cel puțin, prin screeningul supernatantului într-un test ELISA împotriva antigenului. Supernatantul clonelor poate fi, de asemenea, testat pentru aplicații specifice înainte de a se trece la etapa următoare.
Expansiune, crioconservare, producție și purificare
După atingerea statutului monoclonal și performanțe de succes în testele de screening, hibridomurile selectate sunt expandate și congelate în stocuri redundante pentru salvgardare și conservare. Revenirea la aceste stocuri de anticorpi monoclonali permite o consistență de la lot la lot și o performanță fiabilă a anticorpilor. Hibridomii pentru producerea de anticorpi pot fi extinși in vivo prin injectare în peritoneul unei gazde. Această tehnică simplă, cunoscută sub numele de producție de ascită, a căzut în dizgrație, deoarece poate fi extrem de incomodă pentru animalul gazdă. Ca alternativă, tehnicile in vitro la scară largă, cum ar fi producția în flacoane cu role, permit o producție la scară de un litru, mult mai performantă decât tehnicile de ascită. În cele din urmă, o simplă purificare pentru a capta imunoglobulina prin intermediul proteinei A/G este tot ceea ce este necesar pentru a recupera anticorpul pur, deoarece toate celelalte imunoglobuline nedorite au fost eliminate în etapele de diluție limită și de screening.
.