Chromatografie, jak je uvedeno výše, je separační proces zahrnující dvě fáze, jednu stacionární a druhou mobilní. Obvykle je stacionární fází porézní pevná látka (např. sklo, oxid křemičitý nebo oxid hlinitý), která je zabalena do skleněné nebo kovové trubice nebo která tvoří stěny kapiláry s otevřenou trubicí. Mobilní fáze protéká přes plněné lože nebo kolonu. Vzorek, který má být separován, se vstříkne na začátek kolony a je transportován mobilní fází systémem. Při průchodu kolonou se různé látky rozdělují podle své relativní afinity k oběma fázím. Rychlost pohybu závisí na hodnotách distribučních koeficientů, přičemž složky silněji interagující se stacionární fází vyžadují delší dobu pro eluci (úplné odstranění z kolony). Separace je tedy založena na rozdílech v distribučním chování, které se odráží v různých dobách migrace přes kolonu. Stejně jako při opakované extrakci platí, že čím větší je separační faktor pro dvojici složek, tím kratší je kolona potřebná k jejich rozdělení. Chromatografie je tedy analogická vícestupňové extrakci s tím rozdílem, že v chromatografii nejsou žádné přerušované kroky, ale spíše kontinuální tok. V současné době je chromatografie nejvýznamnější metodou separace organických látek a spolu s elektroforézou se nejvíce používá pro biologické látky.
Různé chromatografické metody jsou charakterizovány z hlediska mobilní fáze – plynová: plynová chromatografie (GC); kapalinová: kapalinová chromatografie (LC); nadkritická kapalina: nadkritická kapalinová chromatografie (SFC). Metody se dále dělí z hlediska stacionární fáze; pokud je tedy stacionární fází pevný adsorbent, existují metody jako chromatografie plyn-pevná látka (GSC) a chromatografie kapalina-pevná látka (LSC). Chromatografie se provádí pomocí počítačem řízených přístrojů pro vysokou přesnost a bezobslužný provoz. Kromě toho je za kolonou často umístěn detektor pro analýzu struktury nebo kvantifikaci nebo obojí. Jedním z nejvýkonnějších přístupů analýzy, které jsou nyní k dispozici, je on-line spojení chromatografie s hmotnostní spektrometrií.
Plynová chromatografie je důležitou metodou díky své rychlosti, rozlišovací schopnosti a citlivosti detektoru. Protože je závislá na odpařování, je tato technika nejvhodnější pro sloučeniny, které lze odpařovat, aniž by došlo k jejich rozkladu. Mnoho látek, které se normálně nesnadno odpařují, lze chemicky derivatizovat pro úspěšnou separaci odpařováním pomocí plynové chromatografie.
Kromě chromatografie se k čištění hojně využívá také rozdělení plyn-pevná látka, při kterém se používají speciální adsorbenty zvané molekulová síta. Tyto materiály obsahují póry přibližně stejných rozměrů jako malé molekuly. Této vlastnosti lze využít při separaci molekul s lineární strukturou od molekul s objemnou strukturou. Ty první mohou snadno proniknout do pórů, ale ty druhé do nich proniknout nemohou. To je příklad vylučovacího mechanismu separace (na základě tvarových rozdílů). Molekulární síta hrají důležitou roli také při sušení plynů: voda, polární látka (tj. její čisté kladné a záporné elektrické náboje jsou v molekule rozloženy nerovnoměrně), se na částicích snadno adsorbuje, ale plyny, které jsou méně polární, se na nich neudrží.
Při sublimaci, další metodě rozdělení plynu a pevné látky, se pevná látka vypařuje, aniž by přešla do kapalného stavu. Protože ne všechny látky sublimují, je použitelnost této metody omezená.
Od počátku 70. let 20. století se kapalinová chromatografie vyvinula jako hlavní separační metoda pro organické látky. Vzhledem k tomu, že mobilní fáze je kapalná, odpadá požadavek na odpařování, a proto LC může oddělovat mnohem širší škálu látek než GC. Mezi druhy, které byly úspěšně rozděleny, patří anorganické ionty, aminokyseliny, léčiva, cukry, oligonukleotidy a proteiny. Byla vyvinuta jak kapalinová chromatografie v analytickém měřítku se vzorky na úrovni mikrogramů až miligramů, tak preparativní kapalinová chromatografie na úrovni desítek gramů. V biotechnologiích je kapalinová chromatografie v preparativním měřítku důležitá zejména pro purifikaci proteinů a peptidových hormonů vyrobených rekombinantní technologií.
Jednou z důležitých metod je kapalinová chromatografie v pevné fázi, při níž je porézní adsorbent polární a separace je založena na vlastnostech tříd sloučenin – např. aminů (alkalických) od alkoholů (neutrálních) a esterů (neutrálních) od kyselin.
Kapalinová chromatografie v pevné fázi je nejstarší z chromatografických metod. Až do poloviny 20. století se experimentální postup od své původní podoby příliš nezměnil. Po výrazném zdokonalení se nyní chromatografie kapalina v pevné fázi provádí s porézními částicemi o průměru pouhých 3-5 mikrometrů (0,00012-0,00020 palce) a k pohonu kapaliny přes kolonu naplněnou částicemi se používají kapalinová čerpadla. Dosahuje se vysokého rozlišení a rychlé separace, protože malé částice umožňují dobrou účinnost při vysokých rychlostech mobilní fáze (jeden centimetr za sekundu nebo vyšší). Tato technika je také důležitá při čištění a separované látky lze automaticky shromažďovat za kolonou pomocí sběrače frakcí.
Významným postupem kapalinové chromatografie na pevné fázi je chromatografie na reverzní fázi, při níž je kapalnou mobilní fází voda v kombinaci s organickým rozpouštědlem, jako je methanol nebo acetonitril, a povrch stacionární fáze je nepolární nebo uhlovodíkový. Na rozdíl od normálněfázové chromatografie, kde je povrch adsorbentu polární, v reverzněfázové chromatografii probíhá eluce látek z kolony v pořadí rostoucí polarity. Kromě toho je separace založena na nepolárních aspektech látek. Při separaci řady peptidů z lidského růstového hormonu, rekombinantně vyrobeného léčiva, se používá enzym trypsin, který rozbíjí peptidové vazby obsahující základní aminokyseliny – arganin a lysin – a získává specifický otisk proteinu. Peptidové mapování je zásadní metodou pro hodnocení čistoty složitých látek, jako jsou proteiny.
Iontově-výměnná chromatografie (IEC) je pododdílem kapalinové chromatografie, ale její význam je takový, že si zaslouží zvláštní zmínku. Jak název napovídá, jedná se o separaci iontů; základem separace je různá přitažlivost různých iontů v roztoku k opačně nabitým místům na jemně rozdělené nerozpustné látce (iontoměniči, obvykle syntetické pryskyřici). V kationtově výměnné pryskyřici jsou všechna místa záporně nabitá, takže lze oddělit pouze kladné ionty; iontově výměnná pryskyřice má kladně nabitá místa. Iontově výměnná chromatografie se stala jednou z nejdůležitějších metod separace proteinů a malých oligonukleotidů.
Důležitou aplikací iontové výměny je odstraňování rozpuštěných iontů železa, vápníku a hořčíku z tvrdé vody. Negativní místa na kationtovém výměníku jsou nejprve neutralizována ionty sodíku působením silného roztoku kuchyňské soli (chloridu sodného); při průchodu tvrdé vody pryskyřicí jsou nežádoucí ionty ve vodě nahrazeny ionty sodíku.
Adsorpční chromatografii kapalina-pevná látka lze také provádět na tenkých plochých deskách (tenkovrstvá chromatografie neboli TLC). TLC je levná a rychlá, ale není tak citlivá a účinná jako sloupcová chromatografie. V praxi se adsorbent rozprostře na skleněnou desku a vysuší. Vzorek se nanese jako skvrna poblíž jednoho konce desky, která je umístěna (vertikálně) v mělkém zásobníku obsahujícím mobilní fázi. Jak mobilní fáze stoupá po desce kapilárním působením, vzorek se v kapalině rozpouští a jeho složky jsou transportovány po desce do nových poloh v různých vzdálenostech od výchozího bodu. (Další informace naleznete v článku Chromatografie.)