In vivo je chymotrypsin proteolytický enzym (serinová proteáza) působící v trávicí soustavě mnoha organismů. Usnadňuje štěpení peptidových vazeb hydrolýzní reakcí, která navzdory tomu, že je termodynamicky výhodná, probíhá za nepřítomnosti katalyzátoru extrémně pomalu. Hlavními substráty chymotrypsinu jsou peptidové vazby, v nichž je aminokyselinou na N-konci vazby tryptofan, tyrosin, fenylalanin nebo leucin. Stejně jako mnoho jiných proteáz i chymotrypsin hydrolyzuje amidové vazby in vitro, což je vlastnost, která umožnila použití substrátových analogů, jako je N-acetyl-L-fenylalanin p-nitrofenyl amid, pro enzymové testy.
Chymotrypsin štěpí peptidové vazby útokem na nereaktivní karbonylovou skupinu pomocí silného nukleofilu, serinový zbytek 195 nacházející se v aktivním místě enzymu, který se nakrátko kovalentně naváže na substrát a vytvoří meziprodukt enzym-substrát. Spolu s histidinem 57 a kyselinou asparagovou 102 tvoří tento serinový zbytek katalytickou triádu aktivního místa.
Tyto poznatky se opírají o inhibiční testy a studium kinetiky štěpení výše uvedeného substrátu, přičemž se využívá skutečnosti, že meziprodukt enzym-substrát p-nitrofenolát má žlutou barvu, což umožňuje měření jeho koncentrace měřením světelné absorbance při vlnové délce 410 nm.
Zjistilo se, že reakce chymotrypsinu s jeho substrátem probíhá ve dvou fázích, počáteční „burst“ fázi na začátku reakce a fázi ustáleného stavu podle Michaelis-Mentenovy kinetiky. Způsob účinku chymotrypsinu to vysvětluje tak, že hydrolýza probíhá ve dvou krocích. Nejprve dochází k acylaci substrátu za vzniku acyl-enzymového meziproduktu a poté k deacylaci, při níž se enzym vrátí do původního stavu. K tomu dochází společným působením tří aminokyselinových zbytků v katalytické triádě. Aspartát se vodíkově váže na N-δ vodík histidinu, čímž zvyšuje pKa jeho ε dusíku, a je tak schopen deprotonovat serin. Tato deprotonace umožňuje postrannímu řetězci serinu působit jako nukleofil a vázat se na elektronově deficitní karbonylový uhlík hlavního řetězce proteinu. Ionizace karbonylového kyslíku je stabilizována vytvořením dvou vodíkových vazeb na sousední N-hydrogeny hlavního řetězce. K tomu dochází v oxyaniontové díře. Vzniká tetraedrický adukt a přerušení peptidové vazby. Vzniká acyl-enzymový meziprodukt vázaný na serin a nově vytvořený aminoterminál štěpeného proteinu se může disociovat. Ve druhém reakčním kroku je molekula vody aktivována bazickým histidinem a působí jako nukleofil. Kyslík vody napadá karbonylový uhlík acylové skupiny vázané na serin, což vede ke vzniku druhého tetraedrického aduktu, regeneraci serinové -OH skupiny a uvolnění protonu, jakož i fragmentu proteinu s nově vytvořeným karboxylovým zakončením