Colección de linfocitos
La producción de anticuerpos monoclonales requiere la recolección de las células productoras de anticuerpos que se encuentran en el bazo o en los ganglios linfáticos.
Fusión para crear células de hibridoma
Como las células del bazo tienen tiempos de supervivencia limitados en cultivo, requieren la fusión con mielomas, células B cancerosas, para crear un híbrido inmortalizado que pueda someterse a muchos pasajes in vitro. Esto se consigue mediante polietilenglicol (PEG) o pulsos eléctricos, que interrumpen la membrana celular y permiten la fusión de dos células adyacentes.
Selección de híbridos fusionados
La fusión de células B y mielomas no es 100% eficiente. Por lo tanto, se requiere la selección de híbridos de mieloma y linfocitos. El medio hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) inhibe la síntesis de ADN a través de la aminopterina. Las células B y los híbridos fusionados pueden superar el cultivo en medio HAT ya que poseen timidina quinasa que les permite sintetizar los precursores de la ADN polimerasa necesarios a partir de la timidina suministrada por el medio HAT. Los mielomas no producen timidina quinasa y, en consecuencia, no sobreviven en medio HAT. Aunque las células B mortales contienen timidina quinasa, acaban muriendo debido a su limitada capacidad de replicación in vitro.
Alcanzar la clonalidad con diluciones limitadas
La población de células que sobreviven a la selección sigue siendo heterogénea, y contiene tanto clones múltiples específicos para el antígeno diana como clones que producen anticuerpos con una especificidad irrelevante. Para asegurar la clonalidad se necesitan células individuales, que se consiguen mediante diluciones limitantes. La dilución limitante es una técnica que diluye las concentraciones de placas de la población heterogénea de forma que, estadísticamente, cada pocillo contenga una célula. En la práctica, algunos pocillos pueden no contener células, otros una sola célula y otros múltiples células. Sin embargo, la repetición de este proceso después de las rondas de expansión asegurará que cada pocillo contenga sólo la expansión de una sola célula y, por lo tanto, resultará en la producción de anticuerpos monoclonales idénticos. Cada clon potencial debe probarse mínimamente mediante el cribado del sobrenadante en un ELISA contra el antígeno. El sobrenadante de los clones también puede examinarse para aplicaciones específicas antes de pasar a la siguiente etapa.
Expansión, criopreservación, producción y purificación
Después de alcanzar el estado monoclonal y un rendimiento satisfactorio en los ensayos de cribado, los hibridomas seleccionados se expanden y se congelan en reservas redundantes para su salvaguarda y conservación. La vuelta a estas reservas de anticuerpos monoclonales permite la consistencia de lote a lote y un rendimiento fiable de los anticuerpos. Los hibridomas para la producción de anticuerpos pueden expandirse in vivo mediante la inyección en el peritoneo de un huésped. Esta sencilla técnica, conocida como producción de ascitis, ha caído en desuso ya que puede resultar extremadamente incómoda para el animal huésped. Como alternativa, las técnicas in vitro a gran escala, como la producción en botella de plástico, permiten una producción a escala de litros, superando con creces las técnicas de ascitis. Por último, una simple purificación para capturar la inmunoglobulina a través de la proteína A/G es todo lo que se requiere para recuperar el anticuerpo puro, ya que todas las demás inmunoglobulinas no deseadas fueron eliminadas en las etapas de dilución limitante y cribado.