Récolte des lymphocytes
La production d’anticorps monoclonaux nécessite la collecte des cellules productrices d’anticorps trouvées dans la rate ou les ganglions lymphatiques.
Fusion pour créer des cellules hybridomes
Les cellules de la rate ayant une durée de survie limitée en culture, elles nécessitent une fusion avec des myélomes, des lymphocytes B cancéreux, pour créer un hybride immortalisé pouvant subir de nombreux passages in vitro. Cette fusion est obtenue grâce au polyéthylène glycol (PEG) ou à des impulsions électriques, tous deux perturbant la membrane cellulaire et permettant la fusion de deux cellules adjacentes.
Sélection des hybrides fusionnés
La fusion des cellules B et des myélomes n’est pas efficace à 100%. Il est donc nécessaire de sélectionner les hybrides myélome-lymphocyte. Le milieu hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (HAT) inhibe la synthèse de l’ADN via l’aminoptérine. Les lymphocytes B et les hybrides fusionnés peuvent surmonter la culture en milieu HAT car ils possèdent de la thymidine kinase qui leur permet de synthétiser les précurseurs d’ADN polymérase nécessaires à partir de la thymidine fournie par le milieu HAT. Les myélomes ne produisent pas de thymidine kinase et ne survivent donc pas en milieu HAT. Bien que les lymphocytes B mortels contiennent de la thymidine kinase, ils finissent par mourir en raison de leur capacité limitée de réplication in vitro.
Atteindre la clonalité avec des dilutions limitantes
La population de cellules qui survit à la sélection est toujours hétérogène, contenant à la fois des clones multiples spécifiques de l’antigène cible et des clones produisant des anticorps dont la spécificité n’est pas pertinente. Des cellules uniques sont nécessaires pour assurer la clonalité et sont obtenues par des dilutions limitantes. La dilution limitante est une technique qui consiste à diluer les concentrations de placage de la population hétérogène de telle sorte que statistiquement, chaque puits contienne une cellule. En pratique, certains puits peuvent ne contenir aucune cellule, d’autres une seule et d’autres encore plusieurs. Cependant, en répétant ce processus après des cycles d’expansion, on s’assure que chaque puits ne contient que l’expansion d’une seule cellule, ce qui permet de produire des anticorps monoclonaux identiques. Chaque clone potentiel doit au minimum être testé par un criblage de surnageant dans un ELISA contre l’antigène. Le surnageant des clones peut également être criblé pour des applications spécifiques avant de passer à l’étape suivante.
Expansion, cryoconservation, production et purification
Après avoir atteint le statut monoclonal et obtenu de bons résultats dans les tests de criblage, les hybridomes sélectionnés sont expansés et congelés dans des stocks redondants pour la sauvegarde et la préservation. Le retour à ces stocks d’anticorps monoclonaux permet d’assurer la cohérence d’un lot à l’autre et la fiabilité des performances des anticorps. Les hybridomes destinés à la production d’anticorps peuvent être développés in vivo par injection dans le péritoine d’un hôte. Cette technique simple, connue sous le nom de production d’ascite, est tombée en désuétude car elle peut être extrêmement inconfortable pour l’animal hôte. Par ailleurs, des techniques in vitro à grande échelle, telles que la production en bouteille à roulettes, permettent une production à l’échelle du litre, ce qui dépasse de loin les techniques d’ascite. Enfin, une simple purification pour capturer l’immunoglobuline via la protéine A/G est tout ce qui est nécessaire pour récupérer un anticorps pur, car toutes les autres immunoglobulines indésirables ont été éliminées lors des étapes de dilution limitante et de criblage.