La chromatographie, comme indiqué ci-dessus, est un procédé de séparation impliquant deux phases, l’une stationnaire et l’autre mobile. Typiquement, la phase stationnaire est un solide poreux (par exemple, du verre, de la silice ou de l’alumine) qui est tassé dans un tube de verre ou de métal ou qui constitue les parois d’un capillaire à tube ouvert. La phase mobile s’écoule à travers le lit tassé ou la colonne. L’échantillon à séparer est injecté au début de la colonne et est transporté dans le système par la phase mobile. Au cours de leur déplacement dans la colonne, les différentes substances se répartissent en fonction de leur affinité relative pour les deux phases. La vitesse de déplacement dépend des valeurs des coefficients de distribution, les composants interagissant plus fortement avec la phase stationnaire nécessitant des périodes plus longues pour l’élution (élimination complète de la colonne). Ainsi, la séparation est basée sur des différences de comportement de distribution reflétées par des temps de migration différents à travers la colonne. Comme dans l’extraction répétitive, plus le facteur de séparation est grand pour une paire de composants, plus courte sera la colonne nécessaire pour les séparer. La chromatographie est donc analogue à l’extraction en plusieurs étapes, sauf qu’en chromatographie il n’y a pas d’étapes discontinues mais plutôt un flux continu. À l’heure actuelle, la chromatographie est la méthode la plus importante pour la séparation des substances organiques et, avec l’électrophorèse, elle est la plus utilisée pour les substances biologiques.
Les différentes méthodes chromatographiques sont caractérisées en termes de phase mobile-gaz : chromatographie en phase gazeuse (GC) ; liquide : chromatographie en phase liquide (LC) ; fluide supercritique : chromatographie en fluide supercritique (SFC). Les méthodes sont ensuite subdivisées en fonction de la phase stationnaire ; ainsi, si la phase stationnaire est un adsorbant solide, on trouve des méthodes telles que la chromatographie gaz-solide (CGS) et la chromatographie liquide-solide (CLS). La chromatographie est réalisée à l’aide d’instruments contrôlés par ordinateur pour une haute précision et un fonctionnement sans surveillance. En outre, un détecteur est souvent placé en ligne après la colonne pour l’analyse de la structure, la quantification ou les deux. L’une des approches d’analyse les plus puissantes actuellement disponibles est le couplage en ligne de la chromatographie à la spectrométrie de masse.
La chromatographie en phase gazeuse est une méthode importante en raison de sa vitesse, de son pouvoir de résolution et de la sensibilité du détecteur. Comme elle dépend de la vaporisation, cette technique convient mieux aux composés qui peuvent être vaporisés sans subir de décomposition. De nombreuses substances qui ne se vaporisent normalement pas facilement peuvent être chimiquement dérivées pour réussir la séparation par volatilisation par chromatographie en phase gazeuse.
En plus de la chromatographie, la distribution gaz-solide est également largement employée pour la purification, en utilisant des adsorbants spéciaux appelés tamis moléculaires. Ces matériaux contiennent des pores ayant approximativement les mêmes dimensions que les petites molécules. Cette propriété peut être exploitée pour séparer les molécules à structure linéaire de celles à structure volumineuse. Les premières peuvent facilement entrer dans les pores, mais les secondes sont incapables d’y pénétrer. Il s’agit d’un exemple de mécanisme de séparation par exclusion (basé sur des différences de forme). Les tamis moléculaires jouent également un rôle important dans le séchage des gaz : l’eau, une substance polaire (c’est-à-dire que ses charges électriques positives et négatives nettes sont inégalement réparties au sein de la molécule), est facilement adsorbée sur les particules, mais les gaz qui sont moins polaires ne sont pas retenus.
Dans la sublimation, une autre méthode de répartition gaz-solide, un solide s’évapore sans passer par l’état liquide. Comme toutes les substances ne se subliment pas, l’applicabilité de la méthode est limitée.
Depuis le début des années 1970, la chromatographie liquide s’est développée comme la première méthode de séparation des substances organiques. Comme la phase mobile est un liquide, l’exigence de vaporisation est éliminée et, par conséquent, la LC peut séparer une gamme de substances beaucoup plus large que la GC. Les espèces qui ont été résolues avec succès comprennent les ions inorganiques, les acides aminés, les médicaments, les sucres, les oligonucléotides et les protéines. La chromatographie liquide à l’échelle analytique, avec des échantillons de l’ordre du microgramme ou du milligramme, et la chromatographie liquide à l’échelle préparative, avec des échantillons de l’ordre du dixième de gramme, ont été développées. En biotechnologie, la chromatographie liquide à l’échelle préparative est particulièrement importante pour la purification des protéines et des hormones peptidiques fabriquées par technologie recombinante.
Une méthode importante est la chromatographie liquide-solide dans laquelle l’adsorbant poreux est polaire et la séparation est basée sur les propriétés des classes de composés – par exemple, les amines (alcalines) des alcools (neutres) et les esters (neutres) des acides.
La chromatographie liquide-solide est la plus ancienne des méthodes chromatographiques. Jusqu’au milieu du 20e siècle, la procédure expérimentale n’avait pas beaucoup changé par rapport à sa forme originale. Après d’importantes améliorations, la chromatographie liquide-solide est maintenant réalisée avec des particules poreuses d’un diamètre de 3 à 5 micromètres (0,00012-0,00020 pouce), et des pompes à liquide sont utilisées pour entraîner le liquide dans la colonne remplie de particules. Des pompes à liquide sont utilisées pour faire passer le liquide dans la colonne remplie de particules. On obtient une haute résolution et des séparations rapides car les petites particules permettent une bonne efficacité avec des vitesses rapides de la phase mobile (un centimètre par seconde ou plus). Cette technique est également importante pour la purification, et les substances séparées peuvent être automatiquement recueillies après la colonne à l’aide d’un collecteur de fraction.
Un procédé important de chromatographie liquide-solide est la chromatographie en phase inverse, dans laquelle la phase mobile liquide est de l’eau combinée à un solvant organique tel que le méthanol ou l’acétonitrile et la surface de la phase stationnaire est non polaire ou de type hydrocarbure. Contrairement à la chromatographie en phase normale, où la surface de l’adsorbant est polaire, dans la chromatographie en phase inverse, l’élution des substances de la colonne se fait dans l’ordre de polarité croissante. En outre, la séparation est basée sur les aspects non polaires des substances. Dans la séparation d’une série de peptides provenant de l’hormone de croissance humaine, un médicament fabriqué par recombinaison, une enzyme, la trypsine, est utilisée pour briser les liaisons peptidiques contenant les acides aminés de base, l’arganine et la lysine, afin d’obtenir une empreinte spécifique de la protéine. La cartographie peptidique est une méthode essentielle pour évaluer la pureté de substances complexes telles que les protéines.
La chromatographie par échange d’ions (CEI) est une subdivision de la chromatographie liquide-solide, mais son importance est telle qu’elle mérite une mention spéciale. Comme son nom l’indique, ce procédé sépare les ions ; la base de la séparation est l’attraction variable des différents ions d’une solution vers des sites de charge opposée sur une substance finement divisée et insoluble (l’échangeur d’ions, généralement une résine synthétique). Dans une résine échangeuse de cations, tous les sites sont chargés négativement, de sorte que seuls les ions positifs peuvent être séparés ; une résine échangeuse d’anions possède des sites chargés positivement. La chromatographie par échange d’ions est devenue l’une des méthodes les plus importantes pour séparer les protéines et les petits oligonucléotides.
Une application importante de l’échange d’ions est l’élimination des ions fer, calcium et magnésium dissous dans l’eau dure. Les sites négatifs d’un échangeur de cations sont d’abord neutralisés avec des ions sodium par exposition à une solution forte de sel commun (chlorure de sodium) ; lorsque l’eau dure passe à travers la résine, les ions indésirables de l’eau sont remplacés par des ions sodium.
La chromatographie d’adsorption liquide-solide peut également être réalisée sur des plaques minces et plates (chromatographie en couche mince, ou CCM). La CCM est peu coûteuse et rapide, mais pas aussi sensible ou efficace que la chromatographie sur colonne. En pratique, l’adsorbant est étalé sur une plaque de verre et séché. L’échantillon est appliqué sous forme de point près d’une extrémité de la plaque, qui est placée (verticalement) dans un réservoir peu profond contenant la phase mobile. Au fur et à mesure que la phase mobile se déplace vers le haut de la plaque par action capillaire, l’échantillon se dissout dans le liquide, et ses composants sont transportés vers le haut de la plaque vers de nouvelles positions à des distances variables du point de départ. (Pour une discussion plus approfondie, voir l’article chromatographie.)