A kromatográfia, mint fentebb említettük, két fázis – egy álló és egy mozgó – elválasztási folyamat. Jellemzően az állófázis egy porózus szilárd anyag (pl. üveg, szilícium-dioxid vagy timföld), amelyet egy üveg- vagy fémcsőbe csomagolnak, vagy amely egy nyitott csövű kapilláris falát alkotja. A mozgó fázis átáramlik a töltött ágyon vagy oszlopon. Az elválasztandó mintát az oszlop elején injektálják be, és a mozgófázis szállítja azt a rendszeren keresztül. Az oszlopon való áthaladás során a különböző anyagok a két fázishoz való viszonylagos affinitásuknak megfelelően oszlanak el. Az út sebessége az eloszlási együtthatók értékétől függ, az állófázissal erősebben kölcsönhatásba lépő komponensek hosszabb időt igényelnek az elúcióhoz (az oszlopból való teljes eltávolításhoz). Így az elválasztás az eloszlási viselkedés különbségein alapul, ami az oszlopon való különböző vándorlási időkben tükröződik. Az ismétlődő extrakcióhoz hasonlóan, minél nagyobb az elválasztási tényező egy komponenspár esetében, annál rövidebb lesz az elválasztásukhoz szükséges oszlop. A kromatográfia tehát analóg a többlépcsős extrakcióval, azzal a különbséggel, hogy a kromatográfiában nincsenek megszakított lépések, hanem folyamatos áramlásról van szó. Jelenleg a kromatográfia a legjelentősebb módszer a szerves anyagok elválasztására, és az elektroforézissel együtt a biológiai anyagok esetében alkalmazzák a legszélesebb körben.
A különböző kromatográfiás módszereket a mozgófázis szempontjából jellemzik – gáz: gázkromatográfia (GC); folyadék: folyadékkromatográfia (LC); szuperkritikus folyadék: szuperkritikus folyadékkromatográfia (SFC). A módszereket ezután tovább osztják az állófázis szempontjából; így ha az állófázis szilárd adszorbens, akkor vannak olyan módszerek, mint a gáz-szilárd kromatográfia (GSC) és a folyadék-szilárd kromatográfia (LSC). A kromatográfiát számítógép-vezérelt műszerekkel végzik a nagy pontosság és a felügyelet nélküli működés érdekében. Ezenkívül gyakran az oszlop után on-line detektort is elhelyeznek a szerkezetelemzés, a mennyiségi meghatározás vagy mindkettő céljából. A ma elérhető egyik leghatékonyabb analitikai megközelítés a kromatográfia on-line összekapcsolása a tömegspektrometriával.
A gázkromatográfia gyorsasága, felbontóképessége és a detektor érzékenysége miatt fontos módszer. Mivel a párologtatástól függ, ez a technika leginkább olyan vegyületekhez alkalmas, amelyek bomlás nélkül párologtathatók. Sok olyan anyag, amely általában nehezen párolog el, kémiailag deriváltatható, hogy a gázkromatográfiával sikeresen elpárologtatható legyen.
A kromatográfia mellett a tisztításhoz széles körben alkalmazzák a gáz-szilárd eloszlást is, speciális adszorbensek, úgynevezett molekulasziták alkalmazásával. Ezek az anyagok körülbelül olyan méretű pórusokat tartalmaznak, mint a kismolekulák. Ez a tulajdonság kihasználható a lineáris szerkezetű molekulák és a terjedelmes szerkezetű molekulák elválasztásában. Az előbbiek könnyen bejutnak a pórusokba, az utóbbiak viszont nem tudnak behatolni. Ez egy példa az elválasztás (alaki különbségeken alapuló) kizárási mechanizmusára. A molekulasziták a gázok szárításában is fontos szerepet játszanak: a víz, amely poláris anyag (azaz nettó pozitív és negatív elektromos töltései egyenlőtlenül oszlanak el a molekulán belül), könnyen adszorbeálódik a részecskéken, de a kevésbé poláris gázokat nem tartják vissza.
A szublimációban, a gáz-szilárd szétválasztás másik módszerében a szilárd anyag anélkül párolog el, hogy átmenne a folyékony állapotba. Mivel nem minden anyag szublimálódik, a módszer alkalmazhatósága korlátozott.
A hetvenes évek eleje óta a folyadékkromatográfia a szerves anyagok elsődleges elválasztási módszerévé fejlődött. Mivel a mozgófázis folyadék, a párolgás követelménye megszűnik, ezért az LC az anyagok sokkal szélesebb körét képes elválasztani, mint a GC. A sikeresen felbontott fajok közé tartoznak a szervetlen ionok, aminosavak, gyógyszerek, cukrok, oligonukleotidok és fehérjék. Mind az analitikai léptékű folyadékkromatográfiát mikrogramm-milligramm szintű mintákkal, mind a preparatív léptékű folyadékkromatográfiát tízgrammos szintre fejlesztették ki. A biotechnológiában a preparatív léptékű folyadékkromatográfia különösen fontos a rekombináns technológiával előállított fehérjék és peptidhormonok tisztításánál.
Az egyik fontos módszer a folyadék-szilárd kromatográfia, amelyben a porózus adszorbens poláris, és az elválasztás a vegyületosztályok tulajdonságai alapján történik – pl. aminok (lúgos) az alkoholoktól (semleges) és észterek (semleges) a savaktól.
A folyadék-szilárd kromatográfia a kromatográfiás módszerek közül a legrégebbi. A 20. század közepéig a kísérleti eljárás nem sokat változott az eredeti formájához képest. Jelentős fejlesztések után a folyadék-szilárd kromatográfiát ma már 3-5 mikrométer (0,00012-0,00020 hüvelyk) átmérőjű porózus részecskékkel végzik, és folyadékszivattyúkkal hajtják a folyadékot a részecskékkel töltött oszlopon keresztül. Nagy felbontás és gyors elválasztás érhető el, mivel a kis részecskék jó hatékonyságot tesznek lehetővé gyors mozgófázis-sebességgel (egy centiméter/másodperc vagy annál nagyobb). Ez a technika a tisztításban is fontos, és az elválasztott anyagok az oszlop után frakciógyűjtővel automatikusan összegyűjthetők.
Egy jelentős folyadék-szilárd kromatográfiás eljárás a fordított fázisú kromatográfia, amelyben a folyékony mobilfázis víz és szerves oldószer, például metanol vagy acetonitril kombinációja, az állófázis felülete pedig nem poláris vagy szénhidrogénszerű. A normál fázisú kromatográfiával ellentétben, ahol az adszorbens felülete poláros, a fordított fázisú kromatográfiában az anyagok elúciója az oszlopról a növekvő polaritás sorrendjében történik. Ezenkívül az elválasztás az anyagok nem poláris aspektusain alapul. A humán növekedési hormonból, egy rekombinánsan előállított gyógyszerből származó peptidek sorozatának elválasztásakor egy enzimet, a tripszint használják a bázikus aminosavakat – arganin és lizin – tartalmazó peptidkötések felbontására, hogy a fehérje specifikus ujjlenyomatát kapják. A peptidtérképezés kritikus módszer az olyan összetett anyagok, mint a fehérjék tisztaságának értékelésére.
Az ioncserélő kromatográfia (IEC) a folyadék-szilárd kromatográfia egyik alosztálya, de jelentősége akkora, hogy külön említést érdemel. Amint a neve is mutatja, az eljárás ionokat választ el; az elválasztás alapja az oldatban lévő különböző ionoknak egy finomszemcsés, oldhatatlan anyagon (az ioncserélőn, általában egy szintetikus gyantán) lévő ellentétes töltésű helyekhez való változó vonzódása. A kationcserélő gyantában minden hely negatív töltésű, így csak pozitív ionok választhatók el; az anioncserélő gyanta pozitív töltésű helyekkel rendelkezik. Az ioncserélő kromatográfia a fehérjék és kis oligonukleotidok elválasztásának egyik legfontosabb módszerévé vált.
Az ioncsere egyik fontos alkalmazása az oldott vas-, kalcium- és magnéziumionok eltávolítása a kemény vízből. A kationcserélő negatív helyeit először nátriumionokkal semlegesítik, ha erős konyhasóoldattal (nátrium-klorid) érintkeznek; amikor a kemény víz áthalad a gyantán, a vízben lévő nemkívánatos ionokat nátriumionok helyettesítik.
A folyadék-szilárd adszorpciós kromatográfia vékony, lapos lemezeken is elvégezhető (vékonyréteg-kromatográfia vagy TLC). A TLC olcsó és gyors, de nem olyan érzékeny és hatékony, mint az oszlopkromatográfia. A gyakorlatban az adszorbenst egy üveglapra terítik és szárítják. A mintát foltként viszik fel a lemez egyik végéhez közel, amelyet (függőlegesen) a mozgófázist tartalmazó sekély tartályba helyeznek. Ahogy a mozgófázis a kapilláris hatás következtében felfelé halad a lemezen, a minta feloldódik a folyadékban, és összetevői a kiindulási ponttól változó távolságra lévő új pozíciókba kerülnek. (További részletekért lásd a Kromatográfia című cikket.)