La cromatografia, come già detto, è un processo di separazione che coinvolge due fasi, una stazionaria e l’altra mobile. Tipicamente, la fase stazionaria è un solido poroso (ad esempio, vetro, silice o allumina) che è imballato in un tubo di vetro o di metallo o che costituisce le pareti di un capillare a tubo aperto. La fase mobile scorre attraverso il letto imballato o la colonna. Il campione da separare viene iniettato all’inizio della colonna e viene trasportato attraverso il sistema dalla fase mobile. Nel loro viaggio attraverso la colonna, le diverse sostanze si distribuiscono secondo la loro affinità relativa per le due fasi. La velocità di viaggio dipende dai valori dei coefficienti di distribuzione, i componenti che interagiscono più fortemente con la fase stazionaria richiedono tempi più lunghi per l’eluizione (rimozione completa dalla colonna). Quindi, la separazione si basa su differenze nel comportamento di distribuzione che si riflettono in diversi tempi di migrazione attraverso la colonna. Come nell’estrazione ripetitiva, più grande è il fattore di separazione per una coppia di componenti, più breve sarà la colonna necessaria per risolverli. La cromatografia è quindi analoga all’estrazione multistadio, eccetto che nella cromatografia non ci sono passi discontinui ma piuttosto un flusso continuo. Attualmente, la cromatografia è il metodo più significativo per la separazione di sostanze organiche e, insieme all’elettroforesi, è il più usato per le sostanze biologiche.
I vari metodi cromatografici sono caratterizzati in termini di fase mobile-gas: gascromatografia (GC); liquido: cromatografia liquida (LC); fluido supercritico: cromatografia a flusso supercritico (SFC). I metodi sono poi ulteriormente suddivisi in termini di fase stazionaria; così, se la fase stazionaria è un adsorbente solido, ci sono metodi come la cromatografia gas-solido (GSC) e la cromatografia liquido-solido (LSC). La cromatografia è condotta con strumentazione controllata da computer per un’alta precisione e un funzionamento non presidiato. Inoltre, un rivelatore è spesso collocato in linea dopo la colonna per l’analisi della struttura o la quantificazione o entrambe. Uno dei più potenti approcci di analisi oggi disponibili è l’accoppiamento on-line della cromatografia alla spettrometria di massa.
La cromatografia a gas è un metodo importante per la sua velocità, il potere risolutivo e la sensibilità del rivelatore. Poiché dipende dalla vaporizzazione, questa tecnica è più adatta ai composti che possono essere vaporizzati senza subire decomposizione. Molte sostanze che normalmente non vaporizzano facilmente possono essere derivatizzate chimicamente per una separazione di volatilizzazione di successo tramite gascromatografia.
Oltre alla cromatografia, la distribuzione gas-solido è anche ampiamente impiegata per la purificazione, utilizzando speciali adsorbenti chiamati setacci molecolari. Questi materiali contengono pori di circa le stesse dimensioni delle piccole molecole. Questa proprietà può essere sfruttata nella separazione di molecole con strutture lineari da quelle con strutture ingombranti. Le prime possono entrare facilmente nei pori, ma le seconde non riescono a penetrare. Questo è un esempio di un meccanismo di separazione per esclusione (basato sulle differenze di forma). I setacci molecolari giocano anche un ruolo importante nell’essiccamento dei gas: l’acqua, una sostanza polare (cioè, le sue cariche elettriche positive e negative nette sono distribuite in modo non uniforme all’interno della molecola), viene prontamente adsorbita sulle particelle, ma i gas che sono meno polari non vengono trattenuti.
Nella sublimazione, un altro metodo di distribuzione gas-solido, un solido evapora senza passare dallo stato liquido. Poiché non tutte le sostanze sublimano, l’applicabilità del metodo è limitata.
Dai primi anni ’70, la cromatografia liquida si è sviluppata come il principale metodo di separazione per le sostanze organiche. Poiché la fase mobile è un liquido, il requisito della vaporizzazione viene eliminato, e quindi la LC può separare una gamma molto più ampia di sostanze rispetto alla GC. Le specie che sono state risolte con successo includono ioni inorganici, aminoacidi, farmaci, zuccheri, oligonucleotidi e proteine. Sono state sviluppate sia la cromatografia liquida su scala analitica con campioni a livello di microgrammi e milligrammi sia la cromatografia liquida su scala preparativa a livello di decine di grammi. In biotecnologia, la cromatografia liquida su scala preparativa è particolarmente importante per la purificazione delle proteine e degli ormoni peptidici prodotti dalla tecnologia ricombinante.
Un metodo importante è la cromatografia liquido-solida in cui l’adsorbente poroso è polare e la separazione è basata sulle proprietà delle classi di composti – per esempio, ammine (alcaline) da alcoli (neutri) ed esteri (neutri) da acidi.
La cromatografia liquido-solida è il più antico dei metodi cromatografici. Fino alla metà del 20° secolo, la procedura sperimentale non era cambiata molto dalla sua forma originale. Dopo significativi miglioramenti, la cromatografia liquido-solido ora è condotta con particelle porose di diametro di 3-5 micrometri (0.00012-0.00020 pollici), e vengono usate pompe per liquidi per guidare il liquido attraverso la colonna riempita di particelle. Si ottengono separazioni ad alta risoluzione e veloci poiché le piccole particelle permettono una buona efficienza con velocità della fase mobile veloci (un centimetro al secondo o più). Questa tecnica è anche importante nella purificazione, e le sostanze separate possono essere raccolte automaticamente dopo la colonna usando un raccoglitore di frazioni.
Un’importante procedura di cromatografia liquido-solida è la cromatografia in fase inversa, in cui la fase mobile liquida è acqua combinata con un solvente organico come metanolo o acetonitrile e la superficie della fase stazionaria è nonpolare o idrocarburica. A differenza della cromatografia a fase normale, in cui la superficie adsorbente è polare, nella cromatografia a fase inversa l’eluizione delle sostanze dalla colonna avviene in ordine di polarità crescente. Inoltre, la separazione si basa sugli aspetti non polari delle sostanze. Nella separazione di una serie di peptidi dall’ormone della crescita umano, un farmaco prodotto in modo ricombinante, un enzima, la tripsina, viene utilizzato per rompere i legami peptidici contenenti gli amminoacidi di base – arganina e lisina – per produrre un’impronta specifica della proteina. La mappatura peptidica è un metodo critico per valutare la purezza di sostanze complesse come le proteine.
La cromatografia a scambio ionico (IEC) è una suddivisione della cromatografia liquido-solida, ma la sua importanza è tale che merita una menzione speciale. Come implica il nome, il processo separa gli ioni; la base della separazione è l’attrazione variabile di diversi ioni in una soluzione verso siti caricati in modo opposto su una sostanza finemente divisa e insolubile (lo scambiatore di ioni, solitamente una resina sintetica). In una resina a scambio cationico tutti i siti sono caricati negativamente, così che solo gli ioni positivi possono essere separati; una resina a scambio anionico ha siti caricati positivamente. La cromatografia a scambio ionico è diventata uno dei metodi più importanti per separare proteine e piccoli oligonucleotidi.
Un’importante applicazione dello scambio ionico è la rimozione di ioni di ferro, calcio e magnesio dissolti dall’acqua dura. I siti negativi su uno scambiatore di cationi vengono prima neutralizzati con ioni di sodio mediante esposizione a una forte soluzione di sale comune (cloruro di sodio); quando l’acqua dura viene fatta passare attraverso la resina, gli ioni indesiderati nell’acqua vengono sostituiti da ioni di sodio.
La cromatografia di adsorbimento solido-liquido può anche essere eseguita su piastre sottili e piatte (cromatografia a strato sottile, o TLC). La TLC è poco costosa e rapida, ma non così sensibile o efficiente come la cromatografia su colonna. In pratica, l’adsorbente viene steso su una piastra di vetro e asciugato. Il campione viene applicato come una macchia vicino a un’estremità della piastra, che è posta (verticalmente) in un serbatoio poco profondo contenente la fase mobile. Mentre la fase mobile risale la piastra per azione capillare, il campione si dissolve nel liquido e i suoi componenti vengono trasportati su per la piastra in nuove posizioni a distanze variabili dal punto di partenza. (Per ulteriori discussioni, vedere l’articolo cromatografia.)