Raccolta dei linfociti
La produzione di anticorpi monoclonali richiede la raccolta delle cellule produttrici di anticorpi presenti nella milza o nei linfonodi.
Fusione per creare cellule ibridoma
Poiché le cellule della milza hanno tempi di sopravvivenza limitati in coltura, richiedono la fusione con mielomi, cellule B cancerose, per creare un ibrido immortalizzato che può essere sottoposto a molti passaggi in vitro. Questo si ottiene attraverso il polietilenglicole (PEG) o impulsi elettrici, entrambi i quali interrompono la membrana cellulare e permettono la fusione di due cellule adiacenti.
Selezione degli ibridi fusi
La fusione di cellule B e mieloma non è efficiente al 100%. Pertanto, è necessario selezionare gli ibridi mieloma-linfociti. Il mezzo ipossantina-aminopterina-timidina (HAT) inibisce la sintesi del DNA attraverso l’aminopterina. Le cellule B e gli ibridi fusi possono superare la coltura in mezzo HAT poiché possiedono la timidina chinasi che permette loro di sintetizzare i precursori della DNA polimerasi necessari dalla timidina fornita dal mezzo HAT. I mielomi non producono timidina chinasi, e di conseguenza non sopravvivono nel mezzo HAT. Sebbene le cellule B mortali contengano la timidina chinasi, alla fine muoiono a causa della limitata capacità di replicazione in vitro.
Raggiungere la clonalità con diluizioni limitanti
La popolazione di cellule che sopravvive alla selezione è ancora eterogenea, contenendo sia cloni multipli specifici per l’antigene target che cloni che producono anticorpi con specificità irrilevante. Per assicurare la clonalità sono necessarie cellule singole, ottenute attraverso diluizioni limitanti. La diluizione limitante è una tecnica che diluisce le concentrazioni di placcatura della popolazione eterogenea in modo tale che, statisticamente, ogni pozzetto conterrà una cella. In pratica, alcuni pozzetti possono non contenere cellule, altri una sola cellula e altri ancora più cellule. Tuttavia, ripetendo questo processo dopo giri di espansione assicurerà che ogni pozzetto contenga solo l’espansione di una singola cellula, e quindi risulta nella produzione di anticorpi monoclonali identici. Ogni potenziale clone dovrebbe essere minimamente testato tramite screening del surnatante in un ELISA contro l’antigene. Il supernatante dei cloni può anche essere esaminato per applicazioni specifiche prima di passare alla fase successiva.
Espansione, crioconservazione, produzione e purificazione
Dopo aver raggiunto lo stato monoclonale e le prestazioni di successo nei saggi di screening, gli ibridomi selezionati vengono espansi e congelati in stock ridondanti per la salvaguardia e la conservazione. Il ritorno a queste scorte di anticorpi monoclonali permette una coerenza da lotto a lotto e prestazioni affidabili degli anticorpi. Gli ibridomi per la produzione di anticorpi possono essere espansi in vivo tramite iniezione nel peritoneo di un ospite. Questa semplice tecnica nota come produzione di asciti è caduta in disuso perché può essere estremamente scomoda per l’animale ospite. In alternativa, le tecniche in vitro su larga scala come la produzione di bottiglie di tamburo permettono una produzione su scala di un litro, superando di gran lunga le tecniche di ascite. Infine, una semplice purificazione per catturare l’immunoglobulina attraverso la proteina A/G è tutto ciò che è richiesto per recuperare l’anticorpo puro, dato che tutte le altre immunoglobuline indesiderate sono state rimosse nelle fasi di diluizione limitante e di screening.