Lymfocytskörd
För att producera monoklonala antikroppar måste man samla in de antikroppsproducerande cellerna som finns i mjälten eller lymfkörtlarna.
Fusion för att skapa hybridomceller
Då mjältceller har begränsad överlevnadstid i kultur kräver de fusion med myelom, cancerartade B-celler, för att skapa en odödlig hybrid som kan genomgå många passager in vitro. Detta uppnås genom polyetylenglykol (PEG) eller elektriska pulser som båda stör cellmembranen och möjliggör sammansmältning av två intilliggande celler.
Selektion av fusionerade hybrider
Fusion av B-celler och myelom är inte 100 % effektiv. Därför krävs selektering av myelom-lymfocythybrider. Hypoxantin-aminopterin-thymidin-medium (HAT) hämmar DNA-syntesen via aminopterin. B-celler och fusionerade hybrider kan klara av att odlas i HAT-medium eftersom de har thymidinkinas som gör att de kan syntetisera nödvändiga DNA-polymerasprekursorer från det thymidin som HAT-mediet tillför. Myelomceller producerar inte tymidinkinas och kan därför inte överleva i HAT-medium. Även om dödliga B-celler innehåller tymidinkinas dör de så småningom på grund av begränsad in vitro replikationsförmåga.
Att uppnå klonalitet med begränsande utspädning
Populationen av celler som överlever urvalet är fortfarande heterogen och innehåller både flera kloner som är specifika för målantigenet och kloner som producerar antikroppar med irrelevant specificitet. Enstaka celler krävs för att säkerställa klonalitet, vilket uppnås genom begränsande utspädning. Begränsande utspädning är en teknik som gör det möjligt att utspädda koncentrationer av den heterogena populationen så att varje brunn statistiskt sett kommer att innehålla en cell. I praktiken kan vissa brunnar inte innehålla några celler, andra en enda cell och andra flera celler. Genom att upprepa denna process efter expansioner kan man dock försäkra sig om att varje brunn endast innehåller expansionen av en enda cell, vilket resulterar i produktion av identiska monoklonala antikroppar. Varje potentiell klon bör åtminstone testas genom screening av supernatanten i en ELISA mot antigenet. Supernatant från kloner kan också screenas för specifika tillämpningar innan man går vidare till nästa steg.
Expansion, kryokonservering, produktion och rening
När de uppnått monoklonal status och lyckade resultat i screeninganalyser expanderas och fryses utvalda hybridomer ner i överflödiga lager för att skyddas och bevaras. Genom att återgå till dessa monoklonala antikroppslager kan man få en enhetlighet från sats till sats och en tillförlitlig antikroppsprestanda. Hybridom för produktion av antikroppar kan expanderas in vivo genom injektion i en värds peritoneum. Denna enkla teknik, som kallas ascitesproduktion, har förlorat sin popularitet eftersom den kan vara extremt obekväm för värddjuret. Alternativt möjliggör storskaliga in vitro-tekniker, t.ex. produktion i rullflaskor, produktion i literskala, vilket vida överträffar ascites-tekniken. Slutligen är enkel rening för att fånga upp immunglobulin via protein A/G allt som krävs för att återvinna rena antikroppar, eftersom alla andra oönskade immunglobuliner avlägsnades i de begränsande utspädnings- och screeningstegen.