Kromatografi är, som nämnts ovan, en separationsprocess med två faser, en stationär och en rörlig. Vanligtvis är den stationära fasen ett poröst fast ämne (t.ex. glas, kiseldioxid eller aluminiumoxid) som är packat i ett glas- eller metallrör eller som utgör väggarna i en kapillär med öppet rör. Den rörliga fasen strömmar genom den packade bädden eller kolonnen. Det prov som skall separeras injiceras i början av kolonnen och transporteras genom systemet med den rörliga fasen. På sin väg genom kolonnen fördelar sig de olika ämnena beroende på deras relativa affinitet för de två faserna. Hastigheten beror på värdena för fördelningskoefficienterna, och de komponenter som interagerar starkare med den stationära fasen kräver längre tid för eluering (fullständigt avlägsnande från kolonnen). Separationen baseras alltså på skillnader i fördelningsbeteende som återspeglas i olika vandringstider genom kolonnen. Liksom vid upprepad extraktion gäller att ju större separationsfaktorn är för ett par komponenter, desto kortare kolonn behövs för att separera dem. Kromatografi är alltså analogt med flerstegsextraktion, förutom att det i kromatografi inte finns några diskontinuerliga steg utan snarare ett kontinuerligt flöde. För närvarande är kromatografi den viktigaste metoden för separation av organiska ämnen och tillsammans med elektrofores är den mest använda för biologiska ämnen.
De olika kromatografiska metoderna kännetecknas av den rörliga fasen – gas: gaskromatografi (GC), vätska: vätskekromatografi (LC), superkritisk vätska: superkritisk vätske-kromatografi (SFC). Metoderna delas sedan in ytterligare med avseende på den stationära fasen. Om den stationära fasen är ett fast adsorbent finns det metoder som gas- och fastkromatografi (GSC) och vätske- och fastkromatografi (LSC). Kromatografi utförs med datorstyrda instrument för hög precision och obevakad drift. Dessutom placeras ofta en detektor efter kolonnen för antingen strukturanalys eller kvantifiering eller båda. En av de mest kraftfulla analysmetoder som nu finns tillgängliga är on-line koppling av kromatografi till masspektrometri.
Gaskromatografi är en viktig metod på grund av dess snabbhet, upplösningsförmåga och detektorkänslighet. Eftersom den är beroende av förångning är denna teknik bäst lämpad för föreningar som kan förångas utan att drabbas av nedbrytning. Många ämnen som normalt sett inte lätt förångas kan kemiskt derivatiseras för framgångsrik separation av förångning med gaskromatografi.
Förutom kromatografi används även gas-fastfördelning i stor utsträckning för rening, med hjälp av speciella adsorbenter som kallas molekylära siktar. Dessa material innehåller porer med ungefär samma dimensioner som små molekyler. Denna egenskap kan utnyttjas för att separera molekyler med linjära strukturer från molekyler med skrymmande strukturer. De förstnämnda kan lätt tränga in i porerna, men de sistnämnda kan inte tränga in. Detta är ett exempel på en uteslutningsmekanism för separation (baserad på formskillnader). Molekylära silar spelar också en viktig roll vid torkning av gaser: vatten, ett polärt ämne (dvs. dess positiva och negativa elektriska nettoladdningar är ojämnt fördelade i molekylen), adsorberas lätt på partiklarna, men gaser som är mindre polära hålls inte kvar.
Vid sublimering, en annan metod för fördelning av gaser och fasta ämnen, avdunstar ett fast ämne utan att passera genom vätsketillståndet. Eftersom inte alla ämnen sublimerar är metodens tillämplighet begränsad.
Sedan början av 1970-talet har vätskekromatografi utvecklats som den främsta separationsmetoden för organiska ämnen. Eftersom den rörliga fasen är en vätska elimineras kravet på förångning, och därför kan LC separera ett mycket bredare spektrum av ämnen än GC. Bland de arter som framgångsrikt har separerats finns oorganiska joner, aminosyror, läkemedel, sockerarter, oligonukleotider och proteiner. Både flytande kromatografi i analytisk skala med prover på mikrogram- till milligramnivå och flytande kromatografi i preparativ skala på tiotalsgramnivå har utvecklats. Inom biotekniken är vätskekromatografi i preparativ skala särskilt viktig för rening av proteiner och peptidhormoner som framställts genom rekombinant teknik.
En viktig metod är vätskekromatografi i fast form där det porösa adsorbentet är polärt och separationen baseras på egenskaperna hos klasser av föreningar, t.ex. aminer (alkaliska) från alkoholer (neutrala) och estrar (neutrala) från syror.
Vätskekromatografi i fast form är den äldsta av de kromatografiska metoderna. Fram till mitten av 1900-talet hade det experimentella förfarandet inte förändrats mycket från sin ursprungliga form. Efter betydande förbättringar utförs vätske-fast-kromatografi nu med porösa partiklar som är så små som 3-5 mikrometer (0,00012-0,00020 tum) i diameter, och vätskepumpar används för att driva vätskan genom den partikelfyllda kolonnen. Hög upplösning och snabba separationer uppnås eftersom de små partiklarna ger god effektivitet med höga hastigheter i den rörliga fasen (en centimeter per sekund eller högre). Denna teknik är också viktig vid rening, och separerade ämnen kan automatiskt samlas upp efter kolonnen med hjälp av en fraktionsuppsamlare.
Ett viktigt förfarande för vätskekromatografi med fast substans är omvänd fas-kromatografi, där den flytande rörliga fasen är vatten i kombination med ett organiskt lösningsmedel, till exempel metanol eller acetonitril, och den stationära fasens yta är opolär eller kolvätenliknande. Till skillnad från normalfas-kromatografi, där adsorbentens yta är polär, sker vid omvänd fas-kromatografi utlösningen av ämnen från kolonnen i stigande polaritetsordning. Dessutom baseras separationen på ämnenas opolära aspekter. Vid separation av en serie peptider från humant tillväxthormon, ett rekombinant framställt läkemedel, används ett enzym, trypsin, för att bryta peptidbindningar som innehåller de basiska aminosyrorna arganin och lysin för att ge ett specifikt fingeravtryck av proteinet. Peptidkartläggning är en viktig metod för att utvärdera renheten hos komplexa ämnen som proteiner.
Ionbyteskromatografi (IEC) är en underavdelning av vätskekromatografi, men dess betydelse är sådan att den förtjänar ett särskilt omnämnande. Som namnet antyder separerar processen joner; grunden för separationen är den varierande attraktionen av olika joner i en lösning till motsatt laddade platser på ett finfördelat, olösligt ämne (jonbytaren, vanligen ett syntetiskt harts). I en katjonbytesharts är alla platser negativt laddade, så att endast positiva joner kan separeras; en anjonbytesharts har positivt laddade platser. Jonbyteskromatografi har blivit en av de viktigaste metoderna för att separera proteiner och små oligonukleotider.
En viktig tillämpning av jonbyte är avlägsnande av lösta järn-, kalcium- och magnesiumjoner från hårt vatten. De negativa platserna på en katjonbytare neutraliseras först med natriumjoner genom att utsättas för en stark lösning av vanligt salt (natriumklorid); när det hårda vattnet passerar genom hartset ersätts de oönskade jonerna i vattnet med natriumjoner.
Vätske-fast-adsorptionskromatografi kan också utföras på tunna, platta plattor (tunnskiktskromatografi, TLC). TLC är billig och snabb men inte lika känslig eller effektiv som kolonnkromatografi. I praktiken sprids adsorbenten på en glasplatta och torkas. Provet appliceras som en fläck nära ena änden av plattan, som placeras (vertikalt) i en grund behållare som innehåller den rörliga fasen. När den rörliga fasen rör sig uppåt på plattan genom kapillärverkan löses provet upp i vätskan, och dess beståndsdelar transporteras uppåt på plattan till nya positioner på varierande avstånd från startpunkten. (För ytterligare diskussion, se artikeln kromatografi.)