In vivo, la chymotrypsine est une enzyme protéolytique (sérine protéase) agissant dans le système digestif de nombreux organismes. Elle facilite le clivage des liaisons peptidiques par une réaction d’hydrolyse, qui, bien que thermodynamiquement favorable, se produit extrêmement lentement en l’absence de catalyseur. Les principaux substrats de la chymotrypsine sont des liaisons peptidiques dans lesquelles l’acide aminé N-terminal de la liaison est un tryptophane, une tyrosine, une phénylalanine ou une leucine. Comme de nombreuses protéases, la chymotrypsine hydrolyse également les liaisons amides in vitro, une vertu qui a permis l’utilisation d’analogues de substrat tels que le p-nitrophényl amide de N-acétyl-L-phénylalanine pour les essais enzymatiques.
La chymotrypsine clive les liaisons peptidiques en attaquant le groupe carbonyle non réactif avec un puissant nucléophile, le résidu sérine 195 situé dans le site actif de l’enzyme, qui se lie brièvement de manière covalente au substrat, formant un intermédiaire enzyme-substrat. Avec l’histidine 57 et l’acide aspartique 102, ce résidu sérine constitue la triade catalytique du site actif.
Ces résultats s’appuient sur des tests d’inhibition et l’étude de la cinétique de clivage du substrat susmentionné, en exploitant le fait que l’intermédiaire enzyme-substrat p-nitrophénolate a une couleur jaune, permettant de mesurer sa concentration par mesure de l’absorbance lumineuse à 410 nm.
La réaction de la chymotrypsine avec son substrat s’est avérée se dérouler en deux étapes, une phase initiale de « burst » au début de la réaction et une phase d’équilibre suivant la cinétique de Michaelis-Menten. Le mode d’action de la chymotrypsine l’explique par le fait que l’hydrolyse a lieu en deux étapes. D’abord, l’acylation du substrat pour former un intermédiaire acyl-enzyme, puis la désacylation pour ramener l’enzyme à son état initial. Cela se produit grâce à l’action concertée des trois résidus d’acides aminés de la triade catalytique. L’aspartate se lie par hydrogène à l’hydrogène N-δ de l’histidine, augmentant le pKa de son azote ε, ce qui lui permet de déprotoner la sérine. Cette déprotonation permet à la chaîne latérale de la sérine d’agir comme un nucléophile et de se lier au carbone carbonyle déficient en électrons de la chaîne principale de la protéine. L’ionisation de l’oxygène du carbonyle est stabilisée par la formation de deux liaisons hydrogène avec les N-hydrogènes adjacents de la chaîne principale. Cela se produit dans le trou de l’oxyanion. Cela forme un adduit tétraédrique et la rupture de la liaison peptidique. Un intermédiaire acyl-enzyme, lié à la sérine, est formé, et l’extrémité aminée nouvellement formée de la protéine clivée peut se dissocier. Dans la deuxième étape de la réaction, une molécule d’eau est activée par l’histidine basique, et agit comme un nucléophile. L’oxygène de l’eau attaque le carbone carbonyle du groupe acyle lié à la sérine, ce qui entraîne la formation d’un second adduit tétraédrique, la régénération du groupe -OH de la sérine, et la libération d’un proton, ainsi que le fragment de protéine avec l’extrémité carboxyle nouvellement formée
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